丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂高通量筛选模型的建立及应用.pdfVIP

中 国 医 学 科 学 院 学 报 ACTA ACADEMIAE MEDICINAE SINICAE · 技术与方法 · 丙型肝炎病毒蛋白酶抑制剂高通量 筛选模型的建立及应用 李健蕊，武燕彬，司书毅，陈鸿珊，蒋建东，彭不eL--,根 中国医学科学院 北京协和医学院 医药生物技术研究所病毒室，北京 100050 通信作者：彭宗根 电话 ：010电子邮件 ：pumcpzg@126．con 摘要：目的 应用荧光共振能量转移 (FRET)法检测丙型肝炎病毒 (HCV)丝氨酸蛋白水解酶 (NS3—4A)活 性，建立HCV蛋白酶抑制剂筛选模型。方法 将质粒 pMAL-c2／NS3．4A转化到大肠杆菌K TB 中，经异丙基．p．D．硫 代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达，亲和层析柱纯化得到麦芽糖结合的NS3—4A融合蛋白，用FRET法测定蛋白水解酶活 性，建立特异性蛋白酶抑制剂筛选模型，优化反应体系，评价模型的可靠性。结果 建立了HCV蛋白酶抑制剂高通量 筛选模型，经优化确定了酶及底物用量。在模型可靠性评价中，z因子高达0．80，变异系数为1．9l％。蛋白酶的Km值 为4．74 moL／L，测得已知HCV蛋白酶抑制剂BILN2061的Ki值为0．30nmo~L。结论 建立的HCV丝氨酸蛋白酶抑制 剂FRET法筛选模型稳定可靠，适用于高通量筛选。 关键词：丙型肝炎病毒；丝氨酸蛋白水解酶；高通量筛选模型；荧光共振能量转移 中图分类号：R373—33 文献标志码：A 文章编号：1000-503X(2011)01—0098—04 DOI：10．3881／j．issn．1000—503X．2011．01．022 EstablishmentandApplicationofHighThroughputScreeningM odelfor HepatitisC VirusNS3-4A ProteaseInhibitorsinvitro LIJian-rui，WU Yan·bin，SIShu—yi，CHEN Hong-shan，JIANGJian—dong，PENG Zong-gen DepartmentofVirology，InstituteofMedicinalBiotechnology，CAMSandPUMC，Beijing100050，China Correspondingauthor：PENG Zong—gen Tel：010E·mail：pumcpzg@126．corn ABSTRACT：Objective Toestablishfluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)assaymethodof detectingproteolyticactivityofnon-structuralprotein3-4A (NS3—4A)serineproteaseofhepatitisCviurs (HCV)forhighthroughputscreeninginhibitorsagainstHCVinvitro．Methods HCVrecombinantplasmid pMAL-c2／NS3—4AwastransformedintotheE．colistrainK12TB1．Maltose-binding—protein(MBP)NS3-4A fusionproteinexpressionwasinducedbyaddingisopropyl-B-D·thiogalacto-pyranoside(IPTG)andpurifiedby