卡介苗ERP基因缺失突变株的构建.pdfVIP

中国人兽共患病学报 124 ChineseJournalofZoonoses 文章编号 ：1002—2694(2011)02—0124—03 卡介苗 ERP基因缺失突变株的构建* 吴 芳，张万江，王 萍，曹旭东，杜 燕，李 蕾，吴江东，章 乐 摘 要：目的 构建卡介苗ERP基 因缺失突变株。方法 分别设计两对引物，通过聚合酶链反应(PCR)的方法扩增 ERP基 因两侧 的2个 目的片段 ，分别插入 pKO质粒 中，构建基 因敲除质粒 pKO—ERP，电转入至卡介苗菌株细胞 内并与 BCG 基 因组 中的ERP基 因同源交换，筛选 出ERP基 因敲除菌株。结果 通过 2次PCR筛选和 1次蔗糖反筛选后得到的、并在含 潮霉素培养基上不能生长的菌株为 ERP基 因敲除菌株。结论 pKO 质粒可作为基 因敲除有用的质粒载体 ，成功构建 了卡介 苗 ERP基 因缺失突变株。 关键词 ：基因敲除；ERP基因；卡介苗菌 中图分类号 ：R372 文献标识码 ：A ConstructionofthestrainofM ycobacterium BCG withERP geneknock—out WU Fang，ZHANGWan—jiang，WANGPing，CAO Xu—dong，DU Yan，LIIei，WUJiang—dong，ZHANG Le ‘DepartmentoJPath0ph siOLogy，MedicalSchool／Laboratoryo7XinjiangEndemic andEthnicDiseasesofShiheziUniversity，Shihezi832002，China) ABSTRACT：ToestablishthestrainofMycobacterium BCG withERPgeneknockout．tWOpairsofprimersweredesigned foramplificationofthetargetedgenewithPCR andinsertedtwofragmentsintopK()plasmid，andthentherecombinantplas— midforERP geneknock—outwasobtained，andnamedpK()ERP geneexchangetookplacewithinthegenomeofBCG after pKO—ERPplasmidwastransformed intoMycobacterium BCG．ThestrainofMycobacterium BCG with ERP geneknock—out wasselected．ThetargetstrainwasthatofthepositivestrainbytWOstepPCR andonestepsucrosecounterselection，without growthinculturemediawithhygomycin．ThestrainofMycobacterium BCG withERPgeneknockoutwasconstructedsuccess— fully．TheplasmidofpKO wasausefultoolforgeneknock—outinMycobacteria． KEY WORDS：geneknockout；erpgene；BCG 卡介苗 (bacillecalmette—guerin，BCG)是 目前 新技术 ，此项技术现 已较为成熟 。基因敲除技术为 全球唯一一种广泛应用于结核病预防的疫苗 ，但其 结核杆菌毒力基因功能的研究，耐药性产生机理 ，抗 免疫保护效果并不理想 ，在不同的人群，其免疫保护 结核杆菌药物筛选及疫苗候选分子的选择等提供了 作用差异较大[1]，效果不稳定，免疫保护率从 0 ～ 一 个有力的工具 。该技术对载体质粒的基本要求就 80 ，并且给 AIDS等免疫功能受损的患者接种卡 是能在大肠杆菌 中进行复制 ，但 由于缺乏分枝杆菌 介苗后还可能导致严重的播散性结核病。输出重复