油酸对肉牛肾周前脂肪细胞增殖与分化的影响.pdfVIP

《中国畜牧兽医学会养牛学分会2011年学术研讨会》论文集 1．1．2仪器 C02培养箱，倒置显微镜，紫外分光光度计，超净工作台 1．2方法 1．2．1牛前脂肪细胞的提取． 按照Aso等(1995)的方’法【51，无菌状态下从脂肪组织中分离前脂肪细胞。用眼科剪和镊子去除 脂肪组织表面肉眼可见的纤维成分和血管，接着剪碎组织块约为lmill3大小，并转入10mL离心管中， 加入约2倍体积的l I型胶原酶，37℃恒温消化1．5h(每5min振荡一次)，再用等体积的 mg／mL 含15％FBS的基础培养基中和消化液，然后用100目和200目的无菌过滤筛依次过滤，收集滤液于另 一无菌的离心管中，1500 min，去除漂浮的脂肪细胞及上清液后，用含15％的FBS的基 rpm离心10 础培养基重悬沉淀细胞，即得牛的前脂肪细胞。 1．2．2前脂肪细胞的培养 (FBS)的DMEM培养基培养贴壁l天后，弃去培养基，分别加入以下四组培养基：①对照组：含 15％FBS的基础培养基，②油酸组：0．1mmol／L、0．2mmol／L、0．3mmol／L的油酸培养基。 1．2．3细胞数量的测定 用四甲基偶氮唑盐(MTT)染色法测定培养第l、2、3天的细胞OD值，方法：每孑L／JIMTT工 作液20比，继续孵育4 h后，吸出培养液，加入150IXL二甲基亚砜(DMSO)，37℃下，平板置水 浴振荡锅中震荡20min后，酶标仪540nlll测OD值。 1．2．4脂肪含量的测定 用油红O染色检测培养第3、4天的细胞的OD值。方法：磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗细胞，10％ 甲醛磷酸盐缓冲液室温固定30min，超纯水漂洗，加入0．5％的油红O工作液染色2h，超纯水漂洗数 次，染色好的放入32℃烘箱中烘干，加少许异丙醇溶脂10一20 rain，酶标仪540nlil测OD值。 1．2．5 LPL活性的测定 收集培养2天的细胞测定细胞LPL活性，具体做法为：用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞液，1000 S， rpm离心5min，离心后的细胞悬浮在三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris．HCl)缓冲液中，超声粉碎30 在4℃下10000 rpm离心10min，取上清液即为分析用液，用LPL试剂盒测定。 1．2．6 FAS活性的测定 收集培养4天的细胞测定FAS活性，分析用液与上面相同。具体方法为：加入11．05mmol／L13． 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(13一NADPH)溶液0．04mL，7．25mmol／L乙酰辅酶A溶液0．04mL，40 ℃的CooktailSolution溶液1．4mL，上清液0．08mL，混合均匀后，340hill条件下测吸光度，再加入 3．51 mmol／L丙二酸单酰辅酶A溶液0．08mL，迅速震动混合l min后，在340nm条件下测吸光度。 1．2．7瘦素和脂联素的测定 收集培养4天的细胞测定瘦素和脂联素，具体做法为：用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞液，1000 min，离心后的细胞悬浮在Tris．HCI缓冲液中，超声粉碎30 rpm离心5 S，在4℃下10000 rpm离心 10 min，吸取上层清液即为分析用液，采用ELISA试剂盒法检测瘦素和脂联素。 1．2．8。数据分析 间差异的显著性。 2结果 ·180· 第=☆盼营养与饲养管理技术 21油酸浓度对前脂肪细胞增殖的影响 表l油酸浓度对前脂肪细胞增殖的影响 油酸浓度 培养天数 InlIlo儿) 第l天 第2天