西农萨能奶山羊性反转个体的性别鉴定.pdfVIP

西农萨能奶山羊性反转个体的性别鉴定 石恒波罗军+朱江江李君赵旺生 (西北农林科技大学动物科技学院，陕西省农业分子生物学重点室验室，陕西杨凌712100) 引言 间性系指在雌雄异体动物中偶尔出现的同时具有雌雄两个性别部分特征的反常个体，也 常常被称为性反转综合症。间性个体在其他哺乳动物中出现的几率很小，在山羊群体中较为 常见。间性山羊中较为多的是雌性向雄性转化的性反转。研究表明间性的出现是发育过程中 性别决定环节发生错乱，造成出生个体性别紊乱，即XY型发育成雌性或者XX型发育成雄 性，或者两种性别的特征兼有，出现部分的性反转。哺乳动物的性别决定是一个复杂的生物 学过程，涉及转录和蛋白翻译等多层面以及多种信号通路的调控。山羊间性是一种严重的繁 殖障碍，对畜牧业生产有较大多危害，因此对间性现象的研究有利于对群体的改良。我们 以试验羊场中出现的5只间性西农萨能奶山羊为对象，运用细胞遗传学和PCR扩增雄性特 异性基因Sry方法对其进行性别鉴定，以期为以后山羊性别决定的分子机理研究奠定基础。 材料与方法 用0．2％的肝素液润湿注射器静脉采集西农萨能间性山羊血液。在无菌条件下，将全血 胎牛血清+2％植物血凝素。每个个体血样两个重复。在终止培养前6h时加入秋水仙素，终 KCL低渗液5mL悬浮， 浓度为0．2“g／mL。培养结束后，离心收集细胞，加入预温的0．075M 低渗处理20min。低渗处理后，加入2mL固定液进行预固定5min，离心收集细胞，再加入 5mL固定液固定30min。重复固定3次，第3次固定后在4℃冰箱静置过夜。第二天除去部 分上清，用剩余多细胞悬液进行滴片，在10％的Giemsa染液中染色20min，清洁水冲洗浮 色，晾干。镜检。 分别采集2只正常公羊、2只母羊和5只间性山羊血样，用血液基因组DNA提取试剂 盒提取基因组DNA。根据山羊Sry序列保守区域设计合成扩增引物。用设计的引物对7个 血样DNA进行扩增，之后进行琼脂糖凝胶检测。将扩增出的条带胶回收，连接pMD．19T 载体，经转化，提取质粒，送南京金思瑞生物技术有限公司测序。 结果 对间性山羊血液染色体镜检结果显示，这些表型偏雄性的西农萨能奶山羊染色体没有发 现明显的移位、缺失等遗传突变。且染色体核型为58+xX。Sry扩增结果显示，扩增的Sry 序列大约280 bp，在正常的公羊DNA中扩增出特异性行很强的条带，在正常母羊以及表 型雄性的间性山羊中并没有出现条带。公司测序结果显示，特异性条带与已经公布的山羊 Sry序列完全一致。由以上结果我们可以判断现有的西农萨能间性山羊是由雌性发生性反转 而来的。 讨论 性别鉴定的方法很多，本试验选择了能够直接鉴定核型的染色体核型分析法，鉴定出 “假”公性间性萨能羊的核型为58+XX，但是，核型分析有其自身的缺点，比如很难准确 判断是否出现突变等，因此，为进一步确定间性萨能羊的性别，我们进一步选用效率高、精 确度高的基于PCR原理的Sry扩增方法。结果显示，两种方法结果一致，并且在间性山羊 中没有Sry基因的出现。由本试验可以看出，在性别决定过程中，即使没有雄性特异性基因 Sry的存在，个体也能发育成雄性。该试验为研究山羊的性别决定以及探讨间性出现的分子 机理奠下基础。 致谢 本研究受农业部奶山羊良种繁育及产业化技术体系建设项目(nyhyzx07—037)资助完成。