西农萨能羊乳腺发育相关miRNA-431的克隆及 序列分析.pdfVIP

BULLETIN 169 2012，VOLUMEl3，NO．1ANIMALBIOTECHNOLOGY 西农萨能羊乳腺发育相关miRNA-431的克隆及其序列分析 郭文娇，李转见，薛璨，孙雨佳，潘虹，蓝贤勇，陈宏+ (西北农林科技大学动物科技学院，陕西省农业分子生物学重点实验室， 陕西杨凌，712100) 引言 控因子，并不直接作用于目的基因而是作用于目的基因转录出来的mRNA，从而 调节目的基因的表达。其参与了细胞的分裂增殖、分化、生物发育及代谢等许多 生物学过程，并在疾病发生发展过程中发挥了巨大作用，己有实验证据表明一些 miRNAs在乳腺上皮细胞的分化增殖过程中发挥重要的调控作用。有研究通过 miRNA芯片已分析出在小鼠的怀孕和哺乳期miRNA．43l具有下调作用，但 miRNA．43l在奶山羊上的研究目前还未见报道。 本研究通过PCR的方法成功克隆了西农萨能奶山羊miRNA．43l的前体序列， 将其前体序列与人、小鼠、牛、绵羊miRNAR．43l的前体序列进行了同源性比 对，预测了其二级结构，并通过测序比对后发现了一处GA的突变。 材料和方法 由于山羊的基因组在NCBI上还没有基因组信息，本研究参照GenBank中牛 (NR 5’． 031063)，设计引物(上游引物： pre—miRNA一43l序列 CCCTTCTCAGGTGGTTCCC．3’； 3’)，用西农萨能奶山羊的DNA作为模板进行PCR扩增。利用blast：将克隆得到的 029965)、小鼠(NR029951)、 西农萨能奶山羊pre-miRNA-431序列与人(NR 牛(NR 1序列二级结构 031063)、绵羊的序列进行比对。通过对pre-miRNA一43 的预测，分析其折叠自由能，A+U的含量等，进一步验证西农萨能奶山羊pre- miRNA一43 1序列的正确性。经过测序比对发现在西农萨能奶山羊pre．miRNA- 431序列的第93个碱基处有一处GA的突变。 结果与讨论 本试验成功克隆了西农萨能奶山羊pre—miRNA-431序列，扩增片段总长度为 616 bp，其中392—505bp为pre—miRNA一43l序列，长为114bp。将其序列与人、 小鼠、牛、绵羊的序列进行同源性比对，同源性分别为9396、97％、96％和99％。 人、小鼠、牛、绵羊的pre—miRNA-43l序列与相应的西农萨能奶山羊序列相似性 很高，这说明pre—miRNA一431序列有很高的保守性。同时本试验预测了pre— miRNA一431的二级结构，发现其分子中没有环状结构，在发夹结构中miRNA- 为40．35％，成熟的miRNA一431序列在前体序列的5’端，其与人、小鼠的序列存在 2个碱基的差异，与牛和绵羊的序列完全相同，这进一步说明这个我们克隆的西 农萨能奶山羊miRNA一43l序列是正确的。最后通过比对不同山羊个体序列发现在 西农萨能奶山羊长度为114 miRNA一431通过作用靶mRNA在转录后水平对基因表达调控的研究奠定了基础。 关键词：西农萨能奶山羊；miRNA．431；克隆；序列分析 致谢：本研究由国家自然科学基金(No．No，陕西省科技新星项目 誊通讯作者。