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益气活血方抗大鼠肝纤维化的实验研究 江宇泳王宪波王融冰 北京地坛医院首都医科大学传染病研究所(100011) 肝纤维化一旦发生很难逆转，中医学认为肝纤维化的病机关键为湿热疫毒残留难尽，正气虚弱 是内因，瘀血阻络是病理基础。益气活血方具有益气活血，清化湿热，化痰散结的功效，本研究以 四氯化碳腹腔注射诱导大鼠肝纤维化，采用Ishak肝病组织病变计分修正方案，结合特殊组织化学染 色研究益气活血方抗肝纤维化的疗效，以免疫组化方法观察大鼠肝组织内a平滑肌肌动蛋白 (a-smoothmuscle actin，a-SMA)的变化，观察益气活血方抗肝纤维化的效果，并初步探讨其可能 的作用机制。 材料和方法 1．材料 SD雄性大鼠50只，清洁级，体重180-J：log，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。中药 饮片购自北京卫仁中药饮片厂。小鼠抗大鼠a-SMA单克隆抗体：北京中杉金桥生物技术有限公司， 批号：LotMu1280604。 2．益气活血方组成和制备 由黄芪、丹参、党参、白术、陈皮、石菖蒲、黄芩等组成。中药益气活血方水煎成中药原液50ml， 高剂量组以原液灌胃；在中药原液中加入等量的灭菌注射用水稀释，低剂量组以中药稀释液灌胃。 3．大鼠模型制备 肝纤维化模型的建立参考文献的方法，除正常对照组外，其余3组大鼠腹腔注射40％四氯化碳 橄榄油溶液0．2mYl009，每周2次，共8周，建立四氯化碳肝纤维化模型，正常对照组橄榄油溶液 0．2ml／1009代替四氯化碳腹腔内注射。 4．分组与用药 组14只，中药高剂量组14只，中药低剂量组14只。自造模之日起，益气活血方高剂量组予中药原 灌胃。开始灌胃前称量各组大鼠体重，以后每周称量体重1次，按体重调整灌胃药物剂量。 5．观察内容与方法 观察指标包括大鼠体重，肝脾重量，血清转氨酶、胆红素水平；肝组织切片经HE染色及Masson 染色，采用国际通用的Ishak肝病组织病变计分修正方案进行肝组织学疗效评估，纤维化程度按以下 标准计分：O级：无纤维化；l级：某些汇管区扩大，伴或不伴短纤维间隔：2级；多数汇管区扩大， 伴或不伴短纤维间隔；3级：多数汇管区扩大，偶伴纤维桥；4级：汇管区扩大，伴明显的纤维桥： 5级：明显的纤维桥，偶伴结节形成(不完全硬化)；6级：假小叶形成，肝硬化。 免疫组组织化学染色：石蜡切片常规脱蜡至水一3％的H202溶液，室温，lD血n-÷沸水煮浴， 参照文献制定免疫组化染色阳性细胞计数判定标准：在200倍显微镜下，每张组织切片取5个 视野，分别对肝小叶内、纤维间隔的a-SMA阳性信号进行半定量评分。肝小叶内的ct-SMA阳性信 ．．—．662．——- 阳性信号；3级，50％阳性信号。 6．统计学处理 计量资料采用SPSS13．0统计软件中的ANOVA程序进行单因素方差分析，方差齐性检验，分 WaUis 别采用LSD和Tamhane程序进行两两比较。等级资料采用非参数检验中的KrukalTest进行 比较。 结果 1．大鼠体重、肝脾重量及腹水情况 模型组3只大鼠死亡，其中1只死亡时出现腹水；中药低剂量和高剂量组各有2只大鼠死亡。 造模大鼠体重均显著低于正常组，肝脾重量也低于正常组；模型组2只大鼠、中药高剂量组1只大 鼠出现腹水。 2．大鼠血清ALT、AST活性和TBIL含量变化 著低于模型组(表1)。 表1 各组大鼠血清触』、AST活性和TBIL含量比较(i±s) ⑥p=o．0011⑧p=0．012。 3．各组大鼠肝组织炎症和纤维化评分 模型组汇管区扩大明显，肝细胞气球样变性，脂肪变性明显，Masson染色显示肝小叶结构紊乱， 胶原沉积明显增多，纤维间隔较宽，胶原致密，沿脂变区域延伸，甚至见到假小叶形成。中药低剂 量组、中药高剂量组也有纤维组织增生，程度较轻，纤维间隔较少、较细；肝细胞气球样变性，脂 肪变性均少于模型组。根据Ishak肝病组织病变计分修正方案，计分如表2所示，中药低剂量组、中 药高剂量组炎症和纤维化程度明显轻于模型组。 表2各组大鼠肝组织炎症、纤维化评分比较