1α%2c25-(OH)2D3通过成骨细胞M-CSF途径影响破骨细胞增殖与分化.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜内科学分会 中国·南昌 第七届代表大会暨学术研讨会论文集 引言 【研究意义】目前，奶牛和双蜂驼骨营养不良、幼畜佝偻病、肉仔鸡胫骨软骨发育不良及产蛋禽疲劳 综合症等各种动物骨骼疾病时有发生，严重者达30％以上，给国民经济带来巨大损失【1，21。这些疾病与成 吸收，增强肾小管对钙、磷的重吸收，还能直接作用于骨细胞【4】。大量报道认为，维生素D能通过调节OB 从而间接地调控OC的生成和活化【5咧。同时体外研究发现，RANKL乒t有在巨噬细胞集落刺激因子 (maerophagecolony stimulating mRNA表达的影响，可以从另一分子 道很少。【本研究切入点】因此，观察la25-(OH)2D3对OB内M-CSF 水平揭示维生素D对骨代谢疾病调节的机理。【拟解决的关键问题】本试验采用荧光定量PCR：f去测定了不同 mRNA表达量的影响，并观察了MCSF对OC增殖与分化的影 浓度la，25408)2D3对体外培养OBI内M．CSF 响，为维生素D治疗骨代谢性疾病提供部分理论依据。 1材料与方法 1．1试验动物 出生3^4日龄的SD大鼠乳鼠．5^6周龄ICR雌性小鼠(扬州大学比较医学中心提供)。 1．2主要试剂与耗材 HI SuperSerip USA)；Platinum 染色试剂盒(Sigma)96、24、6孔培养板(Costar)；象牙片(IDS) 1．3主要仪器 江苏省金坛市医疗仪器厂)；日出系列酶标仪(TECANAustriaGes．m．b．H)； 1．40B培养 出生3--4日龄的SD大鼠乳鼠10只，无菌取颅盖骨。参照前述方法【”】，采用两步酶消化法分离培养原 272 中国盲牧兽医学会家畜内科学分会 中国·南昌 第七届代表大会暨学术研讨会论文集 养24 Illl无水乙醇】；Ⅱ：10’mol／L h，更换含血清条件培养液(I：对照组[10pVl00 la,25-(oH)2D3；Ⅲ： 10一mol／L h备用。 1a．，25．(oH)2D3；IV：10订mol／LlⅡ，25．(OH)2D3)继续培养24、48、72 1．50B内M-CSFmRNA表达的测定 1．5．IRNA的提取及检测按TrizolKit说明书提取总RNA。具体步骤如下：弃培养基，用含O．1％ Reagent ml DEPC的无菌PBS漂洗一次；每孔加入1Trizol，吹打使细胞全部裂解，室温放置5nfin，转移至相应离 mlTrizol液加入0．2 s：取上层 心管，．70C保存备用；每l IIll氧仿，盖紧离心管，用手剧烈振荡离心管15 000 水相于新离心管，每管加入0．5ml异丙醇，室温放置10min，12 Blill；弃上清，每管至少加 g离心10 入lml 500 mill(不宜过干， 75％乙醇，涡旋混匀，4℃，7g离心5min；小心弃上清，室温或真空干燥5～10 否贝,[JRNA溶解度降低)；55℃巧O℃水溶解10 备用。 mRNA、M-CSFmRNA全序列设计引物见表1： 1．5．2引物设计根据GenBank中鼠p-aetin 表1RT-PCR应用的引物序