巨噬细胞介导的非特异性免疫炎症反应在急性一氧化碳中毒脑损伤中的作用研究.pdfVIP

中华医学会第二十次全国高压氧医学学术会议论文汇编 ·95· 1．2 CO气体的制备 将甲酸加入浓硫酸中，置于60℃～80℃水浴锅上加热，即有CO气体产生，用氢氧化钠吸收其中 的酸雾，即可得到纯净的CO气体，将制备的CO气体收集于球囊中备用。 1．3急性一氧化碳中毒大鼠模型的建立 参照文献复制急性CO中毒大鼠模型。在密闭的容器(DWC450—1150型动物实验高压氧舱)内， min，然后再呼吸体积分数为3000ppm的CO气体20 大鼠呼吸体积分数为2000ppm的CO气体40 min，直至意识丧失，再呼吸空气直至意识恢复。染毒期间用CO检定管监测染毒装置中CO的浓度。 1．4组织病理学实验 用2％戊巴比妥钠将大鼠腹腔麻醉后灌注、取脑，进行石蜡切片。根据大鼠脑定位；图谱选取冠状 切面海马与齿状回互包平面连续切片。石蜡切片厚度10／xm做髓鞘特殊染色；石蜡切片厚度3肛m做免 疫组织化学染色和免疫荧光染色。 1．5细胞超微结构观察 新鲜大脑标本，切成lmm3的小块，置于2．5％戊二醛中，四氧化锇固定，环氧树脂包埋、超薄切 片、铀一铅双染色后，用透射电镜观察海马区的超微结构变化。 1．6髓鞘特殊染色(牢克坚牢蓝染色) 用饱和碳酸锂液分化直至灰质和白质区分清楚后，自来水洗5min，显微镜下检查分化程度，最后用结 晶紫液染10～20min，再用自来水洗10min，结晶紫分化剂分化后显微镜下检查分化程度，最后脱水、 透明、封片。 1．7免疫组织化学染色 将石蜡切片脱蜡至水后，对抗原进行热修复后，3％双氧水室温浸泡5～10min以灭活内源性过氧 化物酶，滴加5％BSA封闭液，室温20min，甩去多余液体，不洗。滴加一抗(小鼠抗大鼠ED-1，l t l PBS 洗涤3×5min。DAB棕色显色，在显微镜下控制染色程度，蒸馏水终止反应。常规脱水、透明、封片。 1．8免疫荧光双标 将石蜡切片脱蜡至水后，对切片的处理与免疫组化完全相同。滴加一抗时进行双标的两种抗体按照 ：200稀释I兔抗大鼠MBP，1：200稀释)，4℃过夜。0．01mol／LPBS洗3×5min。滴加二抗(绿色 min， 荧光标记的鼠抗和红色荧光标记的兔抗混合，浓度分别为1：100)，37℃温箱2h，PBS洗3×5 甘油封片，在荧光显微镜下进行观察。 1．9 westernblot l l 的TBS中，室温封闭l2h；加入一抗4℃过夜；抗体浓度分别是ED-1(1800)，MIP(1500)和 t s 1000)。洗涤后加入二抗：根据一抗来源选择合适的荧光二抗(15000)，全程避光，室温 fl-actin(1 1h。洗涤后扫膜。将目的蛋白条带的灰度值与内参(p—actin)的灰度值做比较，得相对灰度值。 1．10统计方法 免疫组化染色每个脑组织选5个高倍视野计数其阳性细胞数之和或采用图像分析软件Image—pro plus计算其积分光密度值(10D)，westernblot采用相对灰度值。原始数据计算平均值和标准差，以i 士s表示，运用SPSS 14．0进行统计分析，多样本比较采用单因素方差分析进行显著性检验。检验标准 a一0．05。 中华E学会第=十敬±目高Ⅱ氧《学学丰会议论文忙∞ 2结果 2 1超微结构下神经元和小腔质细胞的观察 电镜下可见正常对照组海马区神经元形态正常，棱膜完整，桉仁清晰，细胞器完整，周围无小腔质 细胞聚集；CO组部分神经元出现缺血性改变，线牲体蜻肿胀断裂．高尔基复合体增大，细胞棱形态尚