新城疫病毒NP基因不同区域与毒力的关系.pdfVIP

g-届全国禽病分子生物技术青年学者论坛论文集 究在ZJl株反向遗传操作平台建立的基础上，以中等毒力NDVBC株NP基因的保守区、可变区及 5’端非编码区分别替换ZJI株的对应区域，成功拯救出了相关表型的重组病毒，并对重组病毒的生 物学特性进行了测定。 1材料和方法 1．1材料 1．1．1毒株、细胞株及鸡胚 鹅源NDV 验种鸡场。 1．1．2质粒和菌株 含NDV 公司；大肠杆菌E．coli DH5a购自Promega公司．NDV多抗血清由本教研室制备并保存。 1．1．3主要试剂 MML．V反转录酶、高保真DNA聚合酶、T4 和质粒抽提试剂盒(QIAprepSpinMiniPrepKit)共J 公司：各种限制性内切酶均购自晶美生物：L程公司。 1．2重组质粒pZJSNP的构建 1．2．1引物设计与合成 根据BeaudetteC全基因组序列，设计下面一对引物用于BC株NP基因的扩增。 GAAGCCTTCTGC CAT．3’ sNPI：5-CCTGAG CAA sNP2：5’．ATCAGTACTCGTGCGGAGITGTACAGCAGG．3’ 引物巾所加酶切位点Ec08117f1]ScaI以黑斜体字标注，引物由．卜海生物工程公司合成。 1．2．2 SNP的构建 RT-PCR及pZJl BC株RNA的抽提按试剂盒说明书提供的步骤进行。病毒RNA以随机引物进行反转录。取反转 录产物3ul用于PCR反应，PCR扩增产物经回收与T载体连接后转化感受态细胞，阳性克隆送上海生物 1．jl；fISca 工程有限公司进行测序验证。阳性克隆经测序正确后，以Ec081 l进行酶切后同收1600bp片段， 与g空Ec081l和Sma I酶切的pNDV／ZJl相连，阳性克隆为pZJSNP(见图1)。 1．3pZJSCR的构建 1．3．1引物的设计与合成 根据NDVZJl和BC株NP基冈序列设计了2对引物如下： sNPl：5．ccTGAGGAAGCCTTCTGCCAACAT．3’ sCR2：5’-I￡Q鱼笪匹△￡I￡鱼IIQ鱼鱼￡△鱼￡△GCT-3’ 265 第二届全国禽病分子生物技术青年学者论坛论文集 AAT-3’ sCR3：5’一!Q￡!鱼￡￡￡△△￡鱼△鱼!笪匹￡￡鱼△AGA sCR4：5’．GCAGTCTCTGGATGTCTCTCTTCTACCCGT-3’ 引物中所加酶切位点Ec081 I以黑斜体字标注，引物由．|：海生物工程公司合成，引物的overlap部 分以下划线显示。 1．3．2 OvedapPCR及pZJSCR的构建 的1303-1818nt区域，再用引物sNPl和sCR4将以上两个扩增片段通过ovedap PCR方法相连。overlap PCR产物经纯化回收与T载体连接后转化感受态细胞，阳性克降进行测序验证。 I和Sma 阳性克隆经测序正确后，以Ec081 l进行酶切后凹收1600bp片段，与经同样酶切的 pNDV／ZJl相连，阳性克隆为pZJSCR(见图1)。 1．4pZJSVR的构建 1．4．1引物的设计与合成 根据NDVZJI和BC株NP基因序列设计了2对引物如下： sVRl：5’．CGAAC℃71(玉4GGGAACCTTCl’ACCGA-3’ GCT-3’ sVR2：5’-I￡鱼鱼△Q△gI￡Q!I鱼鱼鱼gQQ￡△GCA GACCA一3’ sVR3：5’一TQ￡殴￡￡￡△△gQ