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胚胎干细胞的培养及其影响因素 前言 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ESC）是一种高度未分化的、具有发育多潜能性的细胞，可在体外培养扩增、遗传操作，在适当条件下可诱导分化为多种组织细胞，还可与受体胚胎发生嵌合，形成嵌合体，为细胞分化、胚胎发育、肿瘤发生、药物鉴定等方面的深入研究提供了理想的细胞模型，为组织工程、细胞移植、基因治疗等开创了取之不尽、用之不竭的细胞资源。 1981年 Evans 和 Kaufman 将延迟着床的小鼠囊胚接种在经丝裂霉素 C处理的 STO（一种已建系的鼠胚成纤维细胞）上，获得了增殖而未分化的内细胞（inner cell mass,ICM ）， 后经传代克隆，第一个建立了小鼠ES细胞系［1］。 由于小鼠的胚胎干细胞较易发生分化，昆明种属更是如此，成功分离和克隆胚胎干细胞的关键是一方面要促进其分裂增殖，一方面要最大限度抑制其分化。体外生长的细胞直接生长在培养液中，培养液是细胞分离培养中重要的因素[9]。胚胎干细胞对体外培养环境的要求更为严格，其很小的变化都会影响胚胎干细胞的增殖和分化。本课题研究了三种不同培养液对小鼠胚胎干细胞生长的影响，为今后胚胎干细胞建系工作提供一定参考依据。 研究内容与方法 1. 材料 1.1 实验动物 昆明白小鼠。 1.2 主要试剂：PMSG;HCG;DMEM培养液；、 无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液；杜氏磷酸盐缓冲液（PBS液）；0.25% 胰酶-ETDA混合液；丝裂酶素C（Mitomycine,Sigma）；胎牛血清（FCS，浙江生物制品厂）；新生牛血清（ NBS，天津生物制品厂）；白血病抑制因 子；干细胞生长因子；牛胰岛素。[2] 2 小鼠胎儿成纤维细胞的原代培养[3][4][5] 2.1 胚胎的获取 昆明雌性小鼠选择阴道口粘膜色淡红、略湿润的性成熟母鼠，孕马血清（PMSG）16：00腹腔注射10U，48小时后腹腔注射HCG10U，即与雄鼠按1：1合笼交配。次日10：00观察母鼠阴道栓有无，阴道口见阴栓（乳白色或淡黄色蜡状物）即记为妊娠0.5 d，并做标记，同时雌雄分笼喂养。选妊娠11.5-16.5D母鼠进行胎儿成纤维细胞饲养层的制备；将妊娠3.5天孕鼠断颈处死，取出子宫，用含5%NBS的PBS液从子宫角冲出胚胎[6]。 2.2 组织原代培养 2.2.1 改良组织块法[7] (1）在离心管剪碎组织中，加0. 25%胰蛋白酶-0. 02%EDTA，按 1 mL/6胎鼠加入，轻柔吹打30S。 （2）用2倍以上成纤维细胞培养液终止，室温静置5 min，弃上清液，尽量减少组织中消化酶的剩余量。 （3）再加MEF培养液（2.5 mL/胎），吹打混匀组织块。 （4）培养瓶提前用MEF培养液湿润整个瓶底，弃多余汇集的培养液。 （5）将含有组织块的悬液均匀滴入瓶底，组织悬液随即均匀平铺于培养瓶底，不会出现组织块悬浮于培养液滴中现象。 （6）后置于37 ℃、5%CO2、100%RH培养箱中培养； （7）6小时后，将瓶底轻轻翻转平置，避免组织块脱落随培养液流动，后向组织块贴壁的背面补加液体量，继续入培养箱培养过夜； （8）第二天，轻轻翻转培养瓶，使培养液缓慢覆盖组织块，切忌动作过快，使 液体产生的冲力让贴壁的组织块飘起，而造成原代培养失败。37 ℃、5%CO2、 100%RH培养箱继续培养。 （9）第三天，观察组织块贴壁及细胞游出情况，漂浮细胞多或培养液颜色变黄， 将培养液及漂浮细胞全部转移至离心管中，2000rpm，8min离心去除死细胞及未贴壁组织，取上清液及新鲜培养液各一半加入培养瓶中。 2.2.2 简化酶消化法 （1）向离心管剪碎组织中，加入0.05%胰蛋白酶-0. 02%EDTA，以 2.5 mL/6胎鼠，轻柔吹打混匀组织，37℃水浴轻摇晃5min； （2）再加入同量的0.05%胰蛋白酶-0. 02%EDTA 轻柔吹打混匀，轻晃水浴10min； （3）超净工作台内加两倍鼠胚成纤维细胞培养液终止消化，轻吹打，最后可见絮状物将其弃之； （4）需要10cm培养皿个数=胚胎个数×0.8，培养皿个数×10 mL=最终接种细胞悬液量； （5）用培养液补足离心管中液体量，混匀均匀分配于培养皿中。 （6）将培养皿上下左右四个方向，呈“十”字型摇匀细胞，使细胞均匀分布于皿底，置37 ℃、5%CO2、100%RH培养箱中培养。 （7）第二天将培养皿中全部培养液吸弃，连同漂浮死细胞，更换为新鲜成纤维细胞培养液，进行全量换液。 2.3 继代MEF培养 （1）MEF80%-90%长满培养瓶底，弃全部培养液。 （2）预先37 ℃预热的PBS清洗3遍，弃清洗液。 （3）加1ml 0. 05%胰蛋白酶-0. 02%EDTA于培养皿中，四个方向使消