猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒多重TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用.pdfVIP

猪的传染病一猪传染性胃肠炎 原没有共同的抗原性，不能交互免疫，而又有混合感染，因此这就给这两种病的诊治和预防带来了 一定困难。诊断这两种疾病的传统方法有病毒分离、电镜检测、荧光抗体检测、免疫组织化学法等 【4】。虽说上述方法能够鉴别诊断这两种病，但由于实验方法的限制，导致检测耗时过长，无法在病 毒感染初期进行诊断。近年来，随着分子生物学的发展，反转录·聚合酶链式反应O弭PCR)在PEDV 和TGEV检测方面的应用越来越广泛I”，与传统的方法相比较，RT-PCR方法更加敏感、快速、方便， 但步骤繁杂、假阳性较多、缺乏准确定量、灵敏度不够高等妨碍了RT-PCR在实际临床中的应用。1995 年美国PerkinElmer公司研制出新的实时荧光定量PCR(fluorescentquantitativePCR，FQ—PCR)技术IoJ， 从而一举解决了常规PCR的诸多不足之外，使PcR技术得到更新和发展，从而广泛地应用于临床以 及其它相关核酸的研究。为此，本实验根据TaqMan探针荧光定量分析原理，建立了荧光定量RT．PCR 检测PEDv和TGEV的方法，为在临床上无法确诊的混合感染和隐性感染的猪腹泻病例提供了一个快 速的诊断和检测工具。 l材料与方法 1．1病毒、菌种和载体 8．T载体购自大连宝生物工程有限 大肠杆菌Topl0由浙江农科院畜牧兽医研究所保存；pMDl 公司；猪细小病毒(PPv)、猪乙脑病毒(JEV)、猪瘟病毒(SFV)疫苗购自上海生物制品有限公司； 伪狂犬病毒(PRv)、猪圆环病毒2型(PCV2)均由本实验室分离并保存。 1．2主要仪器与试剂 Drop ND．1000购自Themo short 收试剂盒均购于大连宝生物-T程有限公司(TaKaRa)；T7体外转录试剂盒(MEGAscriptTMKit) Viral Mini RNA 购臼Ambion公司；RNA提取试剂盒(QlAampKit)购自QIAGEN公司；组织基因组 DNA提取试剂盒购自上海申能博采公司；Ex．1’aqDNA聚合酶，胶回收试剂盒购于上海生工生物科 技有限公司。基于为国产分析纯试剂。 1．3引物与探针设计 1．3．1 FQ．RT．PCR引物和探针的设计 MiJler 相对保守区域，以PEDVCV777和丁GEV M6株N基因为模扳，根据TaqMan实时荧光定量PCR 反应原理，利用探针设计软件Primer 3．o和Beacon Express Designer4设计出两对引物和两条探针，其 中引物和探针的退火温度相差10℃左右，委托T水aRa公司合成。 1．3．2T7体外转录用引物设计 Premier cV777和TGEVMiller 利用Primer 5．O软件，以PEDV M6株N基因为模板，根据T7体外转 录试剂盒的要求，设计两对引物，分别能够扩增出336bp和346bp的核酸片段，此片段包含有定量 RT。PCR所扩增的片段，引物由上海Invitrogen公司合成。 1．4 体外转录用TGEv-T7和PEDv-T7的大量扩增 为模板扩增目的基因，用DNA纯化试剂盒纯化，把纯化好的DNA连接到pMDl8．T载体中，转化进 量扩增体外转录用DNA，并纯化，测其浓度和纯度。 1．5 RNA标准品的制备 17缓冲液，ATP、CTP、GTP、 根据T7体外转录试剂盒提供的方法进行操作。20山反应体系：2pl UTP(75 mM)各2灶l，转录用DNA(不超过8ug)，2“l转录酶混合物，最后补水至20山：37℃作用2～ Dnase 3小时：加入TURBol“l37℃作用