以病毒RNA核转运为靶点的抗HIV-1药物筛选模型的建立.pdfVIP

以病毒RNA核转运为靶点的抗HIV-1药物筛选模型的建立 刘振龙李晓宇张全贾平平杨亮魏晓露蒋建东岑山· (中国医学科学院医药生物技术研究所免疫生物学室北京100050) 摘要：抗HIV-1感染药物的研究快速发展，目前，临床使用的抗HIV药物主要是逆 转录酶抑制剂和蛋白质合成酶抑制剂。但是，由于这类药物价格昂贵、严重的副作用、毒 性、耐药性等问题日益严重，发展新作用机理的抗HIV-1药物已成当务之急。因此，本课 题以HIV-I病毒RNA核转运为靶点，建立了新型抗HIV药物筛选模型，以期寻找具有新 作用机制的抗病毒药物。Rev蛋白即病毒颗粒蛋白表达调节因子，是HIV-1病毒复制非常 重要的的一个反式激活因子，直接参与病毒蛋白的表达和病毒的增殖，其最为重要的生物 核转运在病毒生活周期中重要的生物学功能，如能特异性地抑制这一核转运过程，且不影 响宿主细胞自身的RNA出核通路，就会成为一新的抗HIV-l策略。根据这一思路，我们建 立了以HIV-I病毒RNA核转运为靶点的新型抗HIV药物筛选模型。在筛选模型中，我们 选择了由HIV-1病毒偏爱性密码子所编码的GFP(GFPHIv)作为报告基因，用于快速简便 地分析样品对Rev依赖的RNA核转运的影响。为了模拟自然条件下HIV-1的非剪切RNAs 的核转运状态，我们在GFPHIv编码序列上下游分别添加了含有HIV-ISD序列的UTR序列 I mRNA通过Rev—CRM GFPmv基因被细胞降解并得以顺利转录；RRE片段可以介导GFPmv GFPHTv 系统受到抑制，则GFPmv的表达水平下降。通过测定GFPHIv的荧光强度，就可以确定化 合物对Rev依赖的核转运的影响。我们先后通过荧光显微镜观察、Westernblot分析以及荧 光强度测定等方法，证明了GFPmv的表达受到RRE／Rev系统的有效调控。选取抑制剂为来 普霉素B作为模型的阳性对照药物对本模型进行了初步评价，计算得出z’因子为0．9602。 对本所化合物库的800个化合物进行了初筛，阳性率为9．3％。上述结果初步证明了该模型 可用于以HIV-1病毒RNA核转运为靶点的新型抗HIV药物的筛选。慢病毒的非剪辑mRNA 和部分剪辑mRNA的核转运都是通过RRE／Rev或者类似的核转运途径来完成。本论文以 病毒HIV．1的Rex,蛋白为靶点建立的筛选模型，筛选得到的药物很可能对所有RRE／Rev或 类似的核转运途径有抑制活性，因而可以发展成为有广谱抗病毒活性的药物。 关键词：艾滋病；抗HIV-I药物；筛选模型；核转运；Rev 基金项目：十一五“新药创制”科技重大专项基金2009ZX09303．005 187 抗HIVol感染药物的研究快速发展，目前，临床使用的抗HIV药物主要是逆转录酶抑 制剂和蛋白质合成酶抑制剂。但是，由于这类药物价格昂贵、严重的副作用、毒性、耐药 性等问题日益严重，发展新作用机理的抗HIV-I药物已成当务之急。因此，本课题以HIV-1 病毒RNA核转运为靶点，建立了新型抗HIV药物筛选模型，以期寻找具有新作用机制的 抗病毒药物。 protein，Rev)， 是HIV-I病毒复制非常重要的的一个反式激活因子，直接参与病毒蛋白的表达和病毒的增 殖。Rev蛋白由HIV-I 显子组成，分别编码25个氨基酸和91个氨基酸的肽段，最终翻译成l16个氨基酸、19KD 性结创31。 Rev蛋白不仅能够促进HIV-I的基因转录由早期向晚期转变，即由调节蛋白基因的转 录向结构蛋白基因的转录进行转变，其最为重要的生物学功能是参与HIV-1mRNA的核转 部分剪辑mRNA、完全剪辑mRNA。在病毒的生命过程中，这些mRNA只有转运出细胞核 of ofvirion element，Rev蛋白效应原件)序列，都是通过Rev(Regulatorexpressionprotein)依赖 性途径从细胞核内转运到细胞质中的。前者作为基因组RNA进行病毒包装，后者作为编码