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实验六植物总RNA的提取及检测,植物总rna的提取,植物rna提取试剂盒,植物rna提取,植物rna的提取方法,trizol法提取植物rna,植物rna提取方法,ctab法提取植物rna,植物根rna提取,植物dna提取实验报告
实验原理:LiCl最终浓度为2 mol/L 0.8 mol/L直接沉淀大分子RNA(包括rRNA和mRNA)需要注意的是Li离子对反转录酶有抑制作用,而Cl离子能抑制蛋白质合成的起始步骤,所以在mRNA反转录和体外翻译实验前不要使用LiCl沉淀DNA和RNA ①所用所有试剂: Tris- CTAB:与RNA结合 β-巯基乙醇:防止被氧化 Tris饱和酚、氯仿:去蛋白质 5L LiCl、无水乙醇、70%乙醇、3 mol/L NaAc:使RNA沉淀 1×TAE、 BW:配制凝胶 Gol-rad或gold-view和6×loading buffer :前沿指示剂 ddH2O ②所有材料 用具 试剂瓶 、250烧杯 玻璃棒 250容量瓶 记号笔 天平 一次性手套 钥匙、 液氮 研钵、冰、线手套、枪、枪头、高压锅、电泳照相系统 离心机 、混摇机、恒温水浴、电泳仪、电泳槽 ③实验准备: 1、CTAB 5g 直接加入试剂瓶(防止起泡) 2、NaCl 20.44g + 0.5M EDTA 12.5ml 用ddH2O 定容至225ml 3、空瓶贴标签加适量(100或50ml)的ddH2O LiCl NaAc 70%乙醇 氯仿 ddH2O 4、6个瓶 + 0.1%DEPC 在通风橱里戴双层手套,充分摇匀,气泡不很快消失 5、37度保温过夜 注意事项: 试剂瓶用洗洁精水浸泡一个小时,然后清水冲到不起泡,壁上不挂水珠,再用ddH2O冲两次,量筒等量器清洗后都用ddH2O冲洗两次 Tris 不可用0.1%DEPC处理,等其他组分处理完再加到CTAB中 所有瓶子用0.1%DEPC处理,除了β-巯基乙醇,Tris饱和酚(购买时小瓶装,直接用即可) 所有水溶试剂用ddH2O配置 加样器100-1000规格的,小于100则不准确 实验流程 1. 3-5倍体积(650ul Tris-CTAB提取缓冲液,50ulβ-巯基乙醇)的65度预热的提取缓冲液,混匀 2. 根据实验需要,取每管0.1-0.5g叶片置液氮中冷冻,研磨成粉末。首先将研钵、杵和钥匙充分冷冻(浇3-4次),加入叶片,加液氮,不超过五次。液氮多的时候轻磨,快没时用劲快磨,至白色为止。 3. 粉末加入准备好的离心管中,大概2匙柄,充分混匀,放在65度恒温浴中15min,每隔2-3min摇一次,研钵和杵放水下冲,氯仿瓶放在冰中。 4. 加入一倍体积(700ul)的氯仿,用混摇机摇匀,12000rpm,离心10min,取上清。 5. 在冰中准备好离心管和氯仿,重复一次。 6. 准备好550ul 5mol/L LiCl,350 ul冷无水乙醇,60ul 3 mol/L NaAc, 加入430ul上清液,静置15-30min,沉淀RNA 7. 12000 rpm离心10min,注意放的方向,抽去上清,RNA沉淀为无色胶体状 8. 用70%乙醇漂洗两次,切忌快速抽打,开口在通风橱里风干(大概15min),再加入20ul的ddH2O,反复抽打混匀,置于冰中备用。 注意事项 1、整个实验过程禁止说话,即在没有条件的情况下,尽量创造一个无RNA酶的环境 2、实验提取过程尽量缩短时间,尽可能放在冰上 3、RNA沉淀为无色胶体状,白色明显沉淀是蛋白质等杂质 4、清洗RNA沉淀时确保沉淀不被冲走,确定其溶解在水中 5、电泳点样一定要迅速,准确,均匀 * * 实 验 六 植物总RNA的提取 *
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