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缺氧对血脑屏障的影响及其分子机制 中文摘要 中文摘要 缺氧对血脑屏障的影响及其分子机制 中枢神经系统的各类疾患：炎症、肿瘤、血管病变和外伤等的病理发生、进展都 会涉及到缺氧这个环节。充分了解缺氧后神经系统解剖、生理变化，对临床认识这些 疾病会有很大帮助。大多数神经科学研究者把目光投向了神经元一中枢神经系统内的 特质细胞。其实缺氧在引起神经元的损伤前，血脑屏障的开放或功能异常已经发生， 但缺氧如何引起血脑屏障的各种生理病理变化的?其分子机制如何?这是我们研究 自9焦点。所以，我们通过体外建立血脑屏障模型，初步探索了缺氧对血脑屏障组成的 重要部分一脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞的影响，以及缺氧对血脑屏障屏障功能 的作用，探讨了其中可能的分子生物学与病理生理机制。 方法：1．采用脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞共培养的三维细胞培养技术建立 体外血脑屏障模型。2．HE染色观察细胞在多聚酯膜上的生长情况。检测共培养以后 血脑屏障特异性酶Y．GT含量；测定经脑微血管内皮细胞间隙进入血脑屏障的荧光素 (分子量66kDa)在血脑屏障模型上的的通透量，以评价血脑屏障模型的功能状态。 3．模拟在体缺氧状态，监测缺氧后不同时间点，脑微血管内皮细胞生长的外环境中氧 乳酸脱氢酶(LDH)的含量；用流式细胞仪检测细胞体积的变化。采用激光共聚焦显 微镜检测细胞浆内游离钙离子的变化。4．通过检测荧光示踪剂荧光素钠(FLU)通过 血脑屏障量的变化，评价缺氧对血脑屏障的屏障功能的影响。5．采用半定量RT-PCR、 影响。 结果：1．用我们的分离培养方法获得的脑微血管内皮细胞在倒置显微镜下细胞 呈多角形或“铺路石”形，单层贴壁生长。培养的细胞Ⅷ因子相关抗原免疫染色阳性， 细胞纯度为90％。采用振荡培养法获得的l型星形胶质细胞GFAP免疫细胞染色呈阳 I 缺氧对血脑屏障的影响及其分子机制 中文摘要 性，阳性细胞纯度达到98％。2．共培养后的内皮细胞表现出典型细胞形态，血脑屏障 cell cell 特异性酶Y-GT含量原代细胞为16．42 U／rag protein，传至第2代为3．69U／mg cell 11．3U／mgprotein、随着共培养，酶活性增强；共培养模型对细胞间转运的低分子 量物质荧光素钠的通透系数为9．0±1．022×10．6cm／s，对经受体转运的牛血清白蛋白 (BSA)在实验进行的l～2小时内的通透表现出一定的饱和性。3．缺氧后，细胞生 验时间内较为恒定，分别为168．7±2．56 皮细胞缺氧后体积经历了一个动态变化的过程，缺氧后的短时间即2-4h体积减小， 随着缺氧时间的延长细胞体积开始增大，而且增大的变化也呈现时间依赖的趋势，在 实验的终末阶段即10．12h，细胞体积的衡量值已经为体积最小时的1．5倍。5．缺氧 趋势。6．脑微血管内皮细胞内的钙离子在极短时间(30min)内迅速增高，而且几乎 立即达到高峰。在缺氧后的4h内，钙离子波尽管有小幅的波动，但始终维持在高水 平。7．低氧发生后的较长时间内(2h．10h)，小分子量示踪剂FLU通过血脑屏障的通 透量并没有太大的变化。而在缺氧时间延长到12h，FLU的通透量增加。8．低氧后紧 无明显改变。9．星形胶质细胞AQP4免疫荧光染色结果提示，AQP4在体外培养的胶 质细胞的胞浆和胞膜上都有表达，随着缺氧时间的延长AQP4的细胞定位没有明显的 又恢复到正常状态。从PVDF膜上的蛋白表达染色可以发现，缺氧4h．6h AQP4的表 达比正常条件时明显增高，随着缺氧时间的延长AQP4的表达再次下降到正常水平。 结论：1．通过脑微血管内皮细胞与l型星形胶质细胞共培养在涂有鼠尾胶的多 孔酯膜的两侧，能够形成与在体血脑屏障类似的结构．并具有在体屏障的限制物质通