遗传性出血性疾病临床和发病机理研究.pdf

遗传性出血性疾病的临床和发病机理研究 中文提要 中文提要 近年来随着人类基因组序列图测定的完成，几乎所有的凝血因子、血小板膜 ’糖蛋白以及其它有关成分的基因都已被克隆，有助于深入探索其结构与功能的关 系。很多遗传性出血性疾病的基因异常已被发现，基因诊断是今后遗传性出血性 疾病研究发展的一个主要方向。 ． 遗传性出血性疾病常导致严重的出血，需要特殊的诊断方法与特别的治疗措 施。我们利用在血栓与止血领域的优势，深入开展遗传性出血性疾病的基础与l临 床研究，阐明其发病的分子机制，解决这类特殊患者的痛苦，并提高我院血栓与 止血的研究水平。 factorXIII 和遗传性凝血因子Xlll缺乏症(hereditary 因分析和家系调查，阐明HAF和HFⅪIID发病的分子机制：研究一种具有异常超 微结构的遗传性巨血小板减少症(hereditary 态与功能。 方法：1．凝血酶法与免疫比浊法测定纤维蛋白原(Fg)，提取HAF家系先证 因所有外显子和侧翼序列，DNA序列分析确定Fg的基因异常。将先证者突变序 I消化，以 列、家系成员和50名正常人相应序列的PCR产物用限制性内切酶Rsa 进一步确定基因突变并排除基因多态性。2．分别用尿素溶解法和试剂盒法检测 HFXIIID患者及其家系成员血浆FXIII的活性，并用火箭电泳法和酶联免疫吸附实 验测定其FXIII抗原含量。PCR法扩增用鲥基因的所有外显子和侧翼序列，DNA I)分析80名正常 测序分析基因异常，用直接测序法和限制性内切酶(SfaNI、Nsp 人相应序列的PCR产物以排除基因多态性。应用生物信息学软件对所发现的突变 进行分子模建，探讨其致病的分子机制。3．采集HMTC患者外周静脉血，分离富 血小板血浆，用流式细胞术结合多种抗血小板膜糖蛋白(GP)单克隆抗体，测定 Ib、GP 血小板膜GP lib、GPIlia、P选择素和CD63的表达；以常规超薄切片术、 免疫电镜技术检测学者血小板及其异常超微结构的性质；用荧光分光光度珐测定 血小板5．羟色胺含量。 结果：1HAF先证者及其父亲的血浆Fg用Clauss珐检测不到，免疫比浊珐测 108位核苷酸发生C—T纯合性 定时，Fg含量均O02∥L，两者FGA基因外显子4第3 遗传性出血性疾病的l艋床和发病机理研究 中文提要 先证者及其父亲FGA基因外显子4和侧翼序列的PCR产物不能被RsaI酶切，而正常 人和该家系中的部分成员可被完全酶切，先证者母亲和家系中其他6个成员的PeR 原约为正常人一半。在患者用鲥基因外显子15中发现两处杂合异常，分别位于 2与core结构域之 析表明，Ar9703和His716两个位点突变后可导致FXIIIA蛋白barrel 间距离和结合能力的改变，使得蛋白质发生错误折叠，稳定性降低。His716--Arg还 可能影响了酶的催化活性的空间结构形成．3．HMTC患者及其父亲血小板表面GP Ib、GP lib和GP IIIa的表达正常，阳性细胞百分数及平均荧光强度与正常对照基本 相同，但P选择素和CD63的表达较高；两者血小板内均有数量不等的高电子密度 大颗粒，有膜包裹，且有胞吐现象：用免疫电镜技术证实该颗粒P选择素、CD63 反应均阴性，可排除超大颗粒为异常的a颗粒或溶酶体的可能性；患者及其父亲 血小板5．羟色胺含量正常，证明超大颗粒不是异常的致密颗粒。 结论：1．FGA基因外显子4