秋顺德质粒DNA提取酶切与PCR鉴定刘安玲.ppt

凝胶准备 胶床准备 铺胶 静置 胶床置于电泳槽中 加电泳缓冲液 拔梳子 上样 电泳 取出凝胶 凝胶成像系统观察结果 电压：80~120V 时间：15~30分钟 实验步骤 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否则温度太高会使制板变形 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔 电泳前，确认样品孔位于电场负极； 点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多 Geldview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔 紫外线照射不要太久 注意事项 上样 每排样品孔预留第一个孔，最后加DNA Marker5000 每个小组加3个样品孔，记住位置 第一孔：5 μl 质粒DNA + 1μl 6×loading buffer混匀后上样 第二孔： 5 μl 酶切产物 + 1μl 6×loading buffer混匀后上样 第三孔： 5 μl PCR产物直接上样 观察电泳结果 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 5000 bp 3000 bp 2000 bp 1500 bp 1000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp M： DL5000 DNA Marker 泳道1,4,7,10 为质粒DNA 泳道2,5,8,11 为PCR产物 泳道3,6,9,12 为酶切产物 酶切长片段 含目的DNA片段的酶切短片段 预期实验结果 思考题 碱法提质粒中溶液I、II、III的作用？ 结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？ 上交实验报告网址： 50/rar/ 灭菌去离子水 4.5 ?l rTaq 12.5 ?l 引物1和2混合液 3 ?l 菌液 5 ?l 总体积 25 ?l 混匀，瞬时离心，使反应液集中于管底，放 PCR仪上 PCR反应体系 （新0.2 ml 离心管） 酶切体系 （新0.2 ml 离心管） 无菌水 9.0 ?l 10×R Buf. 2.0 ?l 质粒DNA 7.0 ?l Hind III 1.0 ?l EcoR I 1.0 ?l 总体积 20.0 ?l 移液枪轻轻混匀(避免产生气泡),瞬时离心，使反应液集中于管底，放恒温水槽 37℃ 水浴1.5h * * 聚合酶链式反应(PCR)扩增DNA片段 * PCR产物中电泳指示剂Orange G略小于100 bp的双链线型DNA的迁移率 * 对于任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此选用适当浓度和适当pH值的Tr is-Cl溶液。加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制 DNase的活性和微生物生长。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。  * NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的相变化所导致。SDS也呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做铺垫。这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。 * SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀。2 M的醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。基因组DNA一旦发生断裂，小于 100 kb的片断，就不容易与 SDS共沉淀。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。这一步操作混合均匀后在冰上放置，可以使SDS沉淀更充分。  * * 底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS及高浓度NaCl等均能抑制酶反应 反应系统：反应缓冲液的主要成分是Tris-Cl、NaCl和Mg2+,离子强度合适可以激发酶切反应，反之会抑制甚至导致酶识别活性的丧失。 反应体积：一般应尽量小，但由于酶的储存液是在50%甘油中，甘油会使很多酶的识别特异性下降，故酶切反应中甘油浓度应低于5% 保温时间与温度：温度改变会使酶识别错误，延长酶切时间可使所需酶量减少。 * PCR产物中电泳指示剂Orange G略小于100 bp的双链线型DNA的迁移率 * 电泳是分离和纯化DNA片段的最常用技术 * 核酸为两性分子,在pH3.5时，整个分子带正电,pH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 * 在琼脂糖凝胶（0.5% ~