第二十二章免疫学检测技术.ppt

第二十二章??????免疫学检测技术的基本原理 教 学 要 求: 1 掌握凝集反应、沉淀反应的定义及其基本类型；间接免疫荧光法、ELISA的双抗夹心法及间接法的基本操作步骤。 2 熟悉检测体液免疫和细胞免疫的常用试验方法。 3 了解免疫学检测方法的应用。 第一节 体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素 抗原抗体反应原理 抗原的抗原决定基与抗体的结合部位之间的结构应具有互补性，二者相互结合后，在适宜条件下，可出现可见反应。 免疫学诊断 一、抗原抗体反应的特点 （一）高度特异性 指一种抗原只能与由它刺激所产生的抗体结合的专一性。它是免疫学诊断的重要基础。 1 亲和力(affinity)：抗体的抗原结合部位与相应的抗原表位间互补结合的强度。 2 一抗： 3 二抗： （二）适宜的抗原抗体浓度和比例： 抗原、抗体比例适合时，在适宜的盐浓度下可形成肉眼可见的反应物（凝集物或沉淀物）。 （三）抗原抗体反应的可逆性： 抗原抗体之间的结合主要是分子表面的非共价键结合，稳定，但在适当条件（如低pH、高浓度盐、冻融等）下可解离开，各自的生物学特性不发生改变。根据此特点，可利用亲合层析法纯化抗原或抗体。 （四）抗原抗体反应分两个阶段 二、抗原抗体反应的影响因素： 1 温度：适当的温度可增加抗原与抗体分子碰撞的机会， 加快二者结合速度。不宜过高过低。 2 电解质：可使IC复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应。常用生理盐水稀释抗原或抗体。 3 酸碱度：最适pH6～8，否则可出现假阴或假阳性结果 4 抗原和抗体性质：抗体的特异性和亲和力是关键，初次应答抗体亲和力低，单克隆抗体亲和力低；抗原理化性质、抗原表位多寡等。 第二节 检测抗原或抗体的体外试验 根据抗原的性质、出现结果的现象、参与反应的成分不同，可将检测抗原抗体反应分为下列几类： （一）凝集反应（agglutination) 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后，在适宜电解质下形成肉眼可见凝集物的反应。 1. 直接凝集：玻片和试管凝集 2 间接凝集： 正相间接凝集和反向间接凝集。 补充介绍： 3. 协同凝集：以SPA为载体的反向间接凝集。在微生物检测中常用。 4. 间接凝集抑制试验： 抗原或抗体的检测方法 （二）沉淀反应（precipitation)： 血清蛋白质、细菌裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后，在有电解质存在时，出现肉眼可见的沉淀物的反应。 1 单向免疫扩散 (single immunodiffusion) （1）特点：定性定量试验 （2）用途：可用于测定血清IgG,IgM,IgA和C3等的含量 （3）原理：沉淀环的直径与抗原含量呈正相关。 （4）操作：铺板 打孔 加样 放湿盒 看结果。 2 双向免疫扩散(double immunodiffusion) （1）特点：定性半定量 （2）用途：用于抗原或抗体的定性检测、组成和多抗原相 关性分析。 （3）操作：铺板 打孔 加样 放湿盒 看结果 。 3 对流免疫电泳试验 （补充介绍） 其实质是将双扩与电泳相结合。 （1）特点：定性试验 （2）用途：主要用于病原微生物抗原的定性检测。 （3）操作：铺板 打孔 加样 电泳 看结果 。 4 免疫电泳 （补充介绍) 也是将电泳技术与双向免疫扩散结合的一种技术，先电泳后双向免疫扩散（见图） 。 5 免疫比浊 （immunoephelometry，补充内容） 在一定量抗体中分别加入递增量的抗原，经一定时间形成IC，液体浑浊，用浊度计测反应体系的浊度，据标准曲线推算样品中抗原含量。 （三）免疫标记技术 P194 用荧光素、酶、放射性核素等标记抗原或抗体后进行抗原抗体反应。提高检测灵敏度、快速、可定性、定量，定位等。 免疫荧光标记技术 1 免疫荧光法 可对标