1DGel分析.ppt

1D-Gel分析 分析DNA、RNA、Protein及WB条带的工具。 分析条带的分子量与质量 1D-Gel工具是凝胶电泳分析软件最基本、最重要的功能。 通过测量条带位置，并与Marker对比来测量条带分子量。 通过测量条带亮度，即累积光密度(IOD)，比较各条带之间质量的相对比例。 修饰照片 使用rotate工具旋转图片，使得凝胶在图片上横平竖直。而且必须将加样孔置于图片上方，否则将影响到条带的分析结果。 将凝胶边上多余的部分裁切掉，既可美化图片画面，也可减少电脑处理数据时的工作量。 旋转并裁切后的照片 设置泳道 1. 点泳道调出泳道设置工具栏及泳道窗口。 2.删除多选上的泳道，增加未选上的泳道。 3.调整泳道位置 4.调整泳道选择宽度及上下边界。 泳道不规则时可以调整泳道为不规则形状的。各泳道宽度也可不一致。 设置完成后点确定关闭泳道窗口。 Lane profile 这是显示泳道上光密度分布曲线的窗口。 曲线下方显示了当前选中泳道的图像。 X与Z菜单用来调整曲线的坐标，一般不必用它，点一下update就可以显示比例合适的曲线。 泳道+与泳道-可以切换选择其他泳道来观察。 Band:设置条带选择 点band按纽后，程序会自动找到一些明显的条带 先删除掉不感兴趣的条带，再把那些未被自动选择的条带加上。 点add band或delete band再到图片上相应位置点一下，就能加上或删去一个条带。还可以在line profile曲线上作这个操作。 调整条带的宽度。 条带宽度的选取原则 每个条带的边界应该是line profile曲线上条带峰的山脚处。 在对不同泳道上的同一分子量各条带进行对比分析时，应保持这些条带的宽度一致。以最宽的那个条带为准。 这两个原则经常不能同时满足，只能根据情况满足其中一条。 各种泳道与条带的选择方式 泳道跑歪了也可以处理 WB图像的条带选择 扣除背景Background correction 扣除背景是必须的操作，在凝胶电泳条带的分析中，背景值经常远大于条带的值，如果不扣除，将会导致条带的分析数据大大偏离其真实数值。切记切记！！！ 扣除背景的必要性 在照片背景较亮时，背景强度对光密度测量值的影响非常大，导致的实验误差也会非常大，所以必须扣除背景。 扣与不扣背景相差甚大 在背景校正中选峰谷连接 设置Marker 如果要测量各条带的分子量，就必须与marker进行对比测量。 在Marker泳道上应该跑出全部Marker条带，也就是说，如果marker有六个条带，那在marker泳道中必须选定六个条带。 如果Marker确实跑丢了一两个条带，则必须在以后的设置中把跑丢的那个值给删除。 当Mark条不在左边时，一定要重新手动指定Mark条的位置 点reset清除。点select按纽，再点照片上marker所在的条带。该条带就被定为marker了。 可以选多个marker条带。 指定了Mark位置后，就要输入各条带的分子量数据。一张照片上只能输入一种Marker参数，如果使用了两种Marker,则只能用一个来定标。 设置M. W. Standard 指定Marker泳道 新建一个Marker参数 输入各条带的分子量数值 定位Marker的各个条带 Slant-倾斜校正。 如果各泳道的速度不一致，此功能可以进行有限的校正。前提是要在两边各作一个同样的Marker。然后在分别在分子量相同的Marker条带上各点一下，它们之间就能拉出一根校正线。这样在分析测量时能够对跑歪的条带分子量进行较正。 可以看结果了。点result. 测量分析结果 光密度分析结果该选哪一项? Rel /bands Amount Rel ab % IOD : 选这个最保险！ Max OD 光密度与样品量之间的关系 正相关，但不是正比。也就是说，光密度相差一倍并不意味着样品的量也相差一倍。 IOD是累积光密度，此项是直接反映了样品量之间的对比。但要注意的是，IOD与样品量之间不是正比关系，因此用IOD的比例来表达两个条带之间的量的对比属于半定量的分析。 其他的定量方法误差更大。 IOD的数值一般都很大，因此读数时要注意别搞错位数。 把数据送到Excel中去处理 点文件中的 输出到Excel 送入Excel中的数据，粗红的数值就是各条带的分子量与光密度值 使用IOD数据作柱状图 1.点选择/不选… 3.在Marker泳道上点一下 4.点此确定按纽 2.弹出此窗口 1.已经指定了Marker泳道 2.点新建 3.在弹出的窗口里输入分子量参数 1.先起个名字 4.这里有显示了才算是被写入 3.点增加将数值写入 2.输入一个数值 5.全部分子量值都写入后点OK 1.刚输入的DL2000 3.分子量数值对应相应的条带 2.点自动定位 2.点确