拟态弧菌外膜蛋白OmpU基因克隆表达及其免疫的保护性及研究.pdf

中文摘要 拟态弧菌(Vibriomimicus)是危害水产动物的重要病原菌之一，不仅可引起鱼蟹 类严重的腹水病，而且还可通过水产动物和水产品感染人类，引起腹泻和食物中毒。 腹水病是我省鱼蟹类养殖中常见的疫病之一，控制腹水病的发生和蔓延已成为水产养 殖业持续发展的关键。细菌外膜蛋白黏附素黏附定植于宿主组织细胞表面是细菌感染 的重要初始环节，否则细菌就不能在局部定居，继而产生毒素或侵入深部组织，引起 感染发生。研制以抗黏附作用为主的外膜蛋白疫苗已成为免疫防治细菌感染最有效的 措施之一。为此，本课题以拟态弧菌外膜蛋白OmpU为靶蛋白，在对ompU克隆表 达的基础上研究融合重组蛋白的抗原性和免疫保护性，旨在为研制OmpU基因工程 疫苗奠定了基础。 PCR扩增、克隆测序和生物信息学分析。 首先，对拟态弧菌安徽分离株进行ompU 研究中根据霍乱弧菌参考株ompU全序列，设计合成2对分别针对ompU部分序列和全 源性在拟态弧菌安徽分离株之间以及与霍乱弧菌参考株之间均较高，分别介于 038 ORF长1bp，编码 94．2％～100％和83．4％～87．6％之间。拟态弧菌HX4菌株ompU 218a砣间有两个明显跨膜域，其二级结构以a．螺旋和B．折叠为主，间或有13转角和无 种具有较好保守性和抗原性的黏附素孔蛋白。 包含BamH I和髓锨I酶切位点的引物，扩增ompU全序列，构建重组表达质粒 pGEX-4T-OmpU并转化至EcoliBL21(DE3)感受态细胞进行原核表达、产物鉴定和可 BL21中表达 溶性分析。结果显示重组表达质粒经IPTG诱导培养4h后，能在E．coli 分子量约为62．9 最后，采用免疫印迹和免疫保护性试验测定融合蛋白GST-OmpU的抗原性和免 电泳后转印至PVDF膜进行Western 种实验小鼠，四次免疫后进行免疫保护性试验。结果显示GST·OmpU和Omps诱导 的某些抗原性，免疫小鼠可部分抵抗50LD50拟态弧菌的攻击，免疫保护率为60％。 表明OmpU是拟态弧菌的保护性抗原之一。 综上所述，本研究从分子水平揭示了ompU在拟态弧菌安徽分离株间以及霍乱弧 菌参考株间具有高度同源性，OmpU是一种具有较好抗原性和保守性的黏附素孔蛋 性，可作为外膜蛋白疫苗的候选抗原。 关键词：拟态弧菌，OmpU基因，克隆表达，免疫保护性 Abstract mimicusisoneofthemain thatharm Vibrio bacteria animals．It pathogenic aquae not leadstoscriousasciticfluiddiseaseoffishandEriocheir alsocauses only sinensis，but humandiarrheaandfoodtoxicosis aninlalsand throughaquatic aquatic in fluiddiseaseisoneofcommondiseasesfishandEriocheirsinensis epidemic cultivation inAnhui occunenccand ofasciticfluiddiseasehasbec