饲料中的氨基酸分析方法.docVIP

饲料中的氨基酸 检测方法包 一. 仪器及试剂 仪 器： 1). 天平一台（精度0.1mg）； 2). 恒温水浴锅一台； 3). 容量瓶； 4). 试管（1.5×15cm或1.5×10cm）； 5). 微量进样器（5ul或10μl）一支； 6). 微量可调移液枪（1000ul）一支、吸头多个；×250mm）； 试 剂： 1). 超纯水（≥18MΩ?cm）； 2). 乙腈（HPLC级）； 3). 三水合醋酸钠（分析纯）； 4). 冰醋酸（分析纯）； 5). 衍生试剂A和衍生试剂B溶液，至于冰箱保存（衍生试剂包对身体有害，用时请做好防护措施）； 6). 正己烷（HPLC级）。 二：样品制备 准确称取饲料0 mg，置于中，加 mol/L盐酸0 mL，搅拌提取15 min，静置分钟，将上清液过滤到100 mL容量瓶中，残渣加 mol/L盐酸mL，搅拌3 min，重复提取两次，，收集滤液并加mol/L盐酸定容至刻度，摇匀。. 流动相的配制 流动相A： 0.1mol/L醋酸钠溶液（pH 6.5）：乙睛＝93：7 配制方法：准确称取三水合醋酸钠13.6g于1000ml水中，搅拌均匀，使之溶解，用冰醋酸或氢氧化钠溶液调pH值至6.5；准确量取配制好的三水合醋酸钠溶液465ml和乙腈35ml，混合均匀，抽滤过0.45μm滤膜； 流动相B：水：乙腈＝20：80 配制方法：准确量取水100ml和乙腈400ml，混合均匀，抽滤过0.45μm滤膜； 四. 衍生化反应 1. 对照品溶液的制备 取月旭公司17种氨基酸对照品溶液用水稀释至原来浓度的1/10倍稀释作为对照品。 Welch公司17种氨基酸对照品溶液稀释10倍后，各氨基酸的浓度为： Name M.W. C(mmol/L) C(mg/ml) Name M.W. C(mmol/L) C(mg/ml) 门冬氨酸 133.10 0.25 0.03328 胱氨酸 240.30 0.125 0.03004 谷氨酸 147.13 0.25 0.03678 缬氨酸 117.15 0.25 0.02929 丝氨酸 105.09 0.25 0.02627 蛋氨酸 149.21 0.25 0.03730 甘氨酸 75.067 0.25 0.01877 异亮氨酸 131.17 0.25 0.03279 组氨酸 155.15 0.25 0.03879 亮氨酸 131.17 0.25 0.03279 精氨酸 174.20 0.25 0.04355 酪氨酸 181.19 0.25 0.04530 苏氨酸 119.12 0.25 0.02978 苯丙氨酸 165.19 0.25 0.04130 丙氨酸 89.093 0.25 0.02227 赖氨酸 146.19 0.25 0.03655 脯氨酸 115.13 0.25 0.02878 2. 供试品溶液制备 精密量取/称取供试品适量，并配制成相应浓度的溶液备用。 3. 衍生步骤 1）将恒温水浴锅预热至50±1℃； 2）分别将衍生试剂；3）精密量取上述对照品溶液1ml置试管中加入A溶液0.ml和稀释后的B溶液0.ml，摇匀在50±1℃水浴中加热45分钟取出加入溶液1ml振摇并用孔径为0.45μm有机膜过滤放置30分钟后取供试品. 色谱条件 1. 色谱柱：Ultimate? AA，5μm，4.6×250mm； 2. 梯度程序： 流动相A： 0.1mol/L醋酸钠溶液（pH 6.5）：乙睛＝93：7 流动相B： 水：乙腈＝20：80 T(min) A% B% 0.01 100.0 0.0 11 93.0 7.0 13.9 88.0 12.0 14 85.0 15.0 29 66.0 34.0 32 30.0 70.0 35 0.0 100.0 42 0.0 100.0 45