全反式维甲酸增强前列腺癌自杀基因治疗的旁观者效应及其及连接蛋白43的关系.pdf

伞反式维r|1陋增强前列腺艏自杀壮肚f治疗的旁观者散心发JUJ连接监山43的关系 中义摘蛰 中文摘要 晚期前列腺癌目前缺乏有效的治疗手段，而基因治疗是治愈filjN腺癌最有希 望的方法之一，也是将来综合治疗中最重要的组成部分。前列腺癌是多阶段、多 基因突变累积的结果，因此，前列腺癌适合基因治疗，而且大量基础和临床实验 己取得治愈或显著缓解的效果。前列腺癌位于局部，解剖上适合于穿刺基因治疗， 且有特异性瘤标，易于随访。 的金标准。HSV-TK基因以及以此为基础联合组织特异性基因启动子或免疫因子基 因等构建的嵌和体基因治疗，是前列腺癌基因治疗中最新进展，理论上效果好， 但实际疗效有待深入研究。HSV-TK／GCV系统抗肿瘤的最重要机制是旁观者效应。 经转染，TK阳性细胞仅为10％就能够杀死周围全部未转染TK阴性的同类肿瘤细 胞，此谓旁观者效应。旁观者效应的物质基础是细胞间缝隙连接(GJ)。GJ由六个 表达在细胞表面的同亚型连接蛋白(Cx)构成的。前列腺组织主要表达Cx43。同类 细胞间的GJ传导能量或信息作用最强，由它介导的细胞间通讯(GJIC)可以决定 细胞的正常分化和生长。Cx表达低下或位于胞浆内时，功能性GJ就不能形成。 当GJIC功能低下时，提示细胞恶性生长、增殖或异常分化。HSV-TK／GCV系统抗 肿瘤效果不佳，或对某些肿瘤细胞无效的原因可能是TK转染率低和／或旁观者效 应低。TK的转染率可以通过应用改善载体来提高，如增殖型腺病毒。旁观者效应 可以通过基因转染Cx基因或化学辅助方法来提高。在目前Cx基因转染率不高的 情况下，诱导Cx表达的化学诱导剂则应用更广泛。这些诱导剂一般对机体无毒或 毒性极低，包括维甲酸、cAMP、类胡萝h素、糖皮质激素等，在诱导Cx表达时 存在细胞组织特异性和Cx类型特异性。 ATRA是肿瘤分化诱导剂的代表，临床用于急性白血病的治疗，取得显著疗效。 ATRA通过与细胞核内受体结合，发挥复杂的生物活性，如抑制细胞生长、促恶性 肿瘤细胞向良性分化、阻挡肿瘤转移、提高免疫应答等。ATRA诱导Cx43表达发 mRNA并降低其被降解。在自杀基因治疗中， 生在Cx43基因转录水平，稳定Cx43 由于TK基因转染肿瘤细胞的DNA中只能保持数小时，因此，诱导Cx43表达要 提前使用ATRA。TK基因持续表达的活性在细胞周期的s期表现显著，而在前列 腺癌细胞中s期的细胞不超过4％，导致治疗效果差，但可以采用腺病毒载体来延 伞反式维r『I胺增强前列腺癖自杀皋W治疗的旁观者效心皮』C’J连接攒[f43的关系 中史摘要 长表达持续时问，或瘤体内多点、重复注射来祢补此缺陷。 本研究以雄激素非依赖性前列腺癌细胞系PC一3作为研究对象，应用ATRA来 处理，了解其生长抑制效果以及与Cx43蛋白表达的关系；同时，在体内外实验中， 者效应。 blot检测ATRA处 制率，并在光学显微镜下观察形态学改变；同时，应用Western 理前后PC．3细胞Cx43蛋白的表达水平，流式细胞仪测定Cx43阳性细胞率，免疫 组织化学SABC法来显示Cx43蛋白在细胞上表达的位置和表达强度。流式细胞仪 旁观者效应，以及联合应用ATRA是否增强旁观者效应，同时采用析因分析法分 析ATRA对Ad—TK／GCV系统旁观者效应的影响。建立26只荷前列腺癌裸鼠模型， 以联合应用ATRA与否来分为实验组和对照组，各13只。实验组和对照组再分为 体积的变化。治疗35天后处死所有荷瘤裸鼠，组织标本行常规病理学检查和 RT-PCR检测TK基因。 胞存活率，形态学上主要以细胞凋亡形式出现；当终浓度≤10’7mol／L时，无抑制 blot 结果显示PC．3细胞仅有微弱Cx43蛋白表达，随着作用时间延长和浓度增加，Cx43 蛋白条带显色同步增强。流式细胞仪检测显示Cx43阳性细胞数增多，从10％上升 法显示，ATRA未处理时，Cx43蛋白在胞膜中和胞浆中微弱显色；经ATRA处理 后，Cx43蛋白在胞膜和胞浆中均大量表达，但以胞膜为主。在MOl200时，第3 天和第5天流式细胞仪检测显示，PC-3细胞被Ad感染的细胞数均稳定在1