B(a)P诱导支气管上皮细胞恶性转化过程中差异甲基化基因的筛选与鉴定.pdfVIP

本课题得到：国家自然科学基金重点项[] (2008，张波)资助。 第二章材料与方法……………………………………………………………………．．22 第三章结果………………………………………………………………………………．．31 第四章讨论……………………………………………………………………………。42 第五章结论………………………………………………………………………………47 参考文献…………………………………………………………………………………48 英文缩略语词汇表………………………………………………………………………53 个人简历………………………………………………………………………………．s4 致谢………………………………………………………………………………………………………………．56 原创性声明…………………………………………………………………………………S7 中文摘要 中山大学博士后出站报告 B(a)P诱导人支气管上皮细胞恶性转化过程中差异甲基化基因的筛选与鉴定 摘要 研究背景 肺癌是世界范围内引起死亡的重要疾病，早期诊断对于肺癌的防治具有重要 意义。目前肺癌筛查的方法有X—ray、螺旋CT(SpiralComputedTomography)、 变检测以及最近几年发展起来的基因甲基化检测，每种方法都有优势和不足之 处，对外周血或痰液中的DNA进行甲基化分析是更有应用前景的肺癌筛查方法。 在毒理学领域，已经证明表观遗传学改变特别是特定基因肩动子区高甲基化 引起的基因沉默是癌症发生的早期事件，多种化学物可以引起基因的异常甲基化 【1．3】，检测生物样本中特定基因的甲基化水平有助于肿瘤的早期诊断。 化学致癌物的判定是一项艰巨、耗时和复杂的工作，其中试验检测方法包括 致突变试验、细胞恶性转化试验和哺乳动物致癌试验(短期、长期)。致突变试 验不能发现非遗传毒性致癌物，动物致癌试验花费大、周期长，难以应付实际需 要；此外，许多啮齿类动物致癌物对人类并没有致癌作用，反之也是如此。同时， 轻试验动物的痛苦；Replacement，替代动物试验)被越来越多的机构认可，动 物试验逐渐不再作为试验阶段的“金标准”。细胞恶性转化试验是理想的短期致癌 性检测试验，它以细胞获得裸鼠体内致瘤能力作为恶性转化的观察终点。 虽然机制并不明确，但基因启动子区高甲基化导致基因沉默提供了除基因突 变之外的第二条抑癌基因失活途径，相对于基因突变位点的不确定性，甲基化改 变主要集中在基因肩动子区的CpG岛。甲基化特异性PCR可以快速、灵敏检测 CpG岛甲基化状态，大大促进了甲基化基因作为肿瘤biomarker的研究。这些研 究虽然提供了有用的线索，但缺乏从细胞到人群流行病学研究相一致的证据。 研究目标 1．评价细胞体外转化模型在致癌物筛查中的价值； 2．发现与肺癌相关的新的生物标志物。 中文摘要 中山大学博士后出站报告 研究内容 1．建立B(a)P诱导永生化人支气管上皮细胞体外转化模型 原代培养的人支气管上皮在导入SV40LT和Ras后，成为处于转化前状态 的永生化细胞，经致癌物B(a)P进行短期诱导即发生恶性转化，细胞转化模型 的建立是研究细胞转化机制的基础。 2．细胞转化过程中差异甲基化基因的筛选 利用MeDIP和芯片技术筛选细胞转化过程中甲基化状态发生规律变化的 基因，为后续biomarker的研究提供线索。 3．肩动子区高甲基化与基因沉默关系的研究 研究细胞转化过程中、特定基因甲基化、基因表达及细胞生物学性状之间 的逻辑关系，获取基因甲基化参与细胞转化的试验证据。 4．靶基因在肺癌标本中的甲基化状态及表达情况 研究细胞水平基因甲基化改变的证据与人群标本的一致性，分析差异的原 因，判断细胞模型的应用价值。． 主要方法 I．细胞株选择和构建 HBE细胞是表达SV40LT的人支气管上皮细胞，HBE细胞有稳定的染色体数 目，统一的大小和形态，具有接触抑制的表型，裸鼠皮下注射不能形成肿瘤。本 实验室在HBE细胞的基础上分别导入稳定表达的H-Ras基因，构建了HBER细 胞株，HBER的生长速度是HBE的2．4倍，HBER不能在软琼脂上生长，不能在 裸鼠皮下形成肿瘤，但毒物