Bacillu cereus低温淀粉酶基因的克隆、表达及分子进化.pdfVIP

Bacillus cereus低温淀粉酶皋I大|的克降、表达及分了进化 Bacillus cereus低温淀粉酶基因的克隆、表达及分子进化 摘要 本研究从废弃淀粉堆中分离筛选到一株产低温淀粉酶的优良菌株 ℃，在0。C仍然具有酶活，当温度高于50℃时酶活迅速降低，符合低温淀 粉酶的特征；最适pH为7．0。通过对其进行菌落形态和理化性质的观察与 cereus 测定，加之结合对其16SrRNA序列比对分析，初步鉴定为Bacillus 属。 cereus 通过同源淀粉酶序列比对，设计引物利用PCR技术从Bacillus 检测，在64kD处有明显表达条带，与预期结果相符。通过镍柱纯化后，对 GXBC．1重组酶的酶学性质进行了测定。其最适温度为35℃，最适pH为 7．0，Km值为O．72 mg／mL，比活力为161．2U／mg，经HPLC检测其主要产 物为葡萄糖和麦芽糖。 本研究还对GXBC．1低温淀粉酶基因进行了定点饱和突变和结构域切 换，以期使GXBC．1低温淀粉酶的酶活提高或产物发生改变。通过同源建 位以及活性位点附近的426位氨基酸作为定点饱和突变位点。通过反向PCR Bacillus 广两人学硕+}：论义 cereus低温淀粉酶皋l大J的克隆、表达及分了进化 变酶E358N较野生酶Km值有了少许降低，说明其与底物的亲和力得到了 加强；反之其余三个突变酶的Km值由于升高相对亲和力降低。突变酶 生酶有了一定的提高。将重组酶GXBC．1f氐温淀粉酶与T．fuscaO【．淀粉酶进 行结构域切换后，其完全丧失了活性。 关键词：分离筛选；Bacillus cereus；低温淀粉酶；克隆表达；定点饱和突 变；结构域切换 II BaciHus 广西人学硕J：论文 cereus低温淀粉酶皋I矧的克降、表达及分子进化 ANDMOLECULAR CLONING．EXPRESSION GENE OFTHECOLD．ADAPTEDAMYLASEFROM删C纪三【胳 CEREUS ABSTRACT Inthis strainGXBC·—1was study,acold··adaptedamylase·-producing screenedandisolatedfrom ofstarch．The scrapheap enzymatic of fromGXBC一1was theresultshowedthat studied，and amylase preliminarily the was from30。Cto the 40*(2，