扩展青霉FS184脂肪酶基因在毕赤酵母GS115中的表达和定向进化研究.pdfVIP

中文摘要 中文摘要 1 提取扩展青霉PenicilliumFS expansum 异源表达，经甲醇诱导，重组脂肪酶基因在毕赤酵母中成功表达，表达量为0．6mg／ml。 NaOH滴定法鉴定重组脂肪酶活力，该重组酶最高比活为2952U／mg，最适作用温度为 35℃，最适pH为9．4。 根据基因一致性原则选择突变位点，采用一步法对脂肪酶基因进行定点诱变， 共选择8个位点进行突变，Leul 02Met，Ilel02Val， 64Pro，Thr50Cys，Met220Val，Ilel 因经电击转化毕赤酵母后成功表达，其中突变体PEL—M220V-GS相对于野生型脂肪 于野生型脂肪酶的耐热性有所提高，PEL．L164P．GS的比活虽然只有野生型重组脂肪 酶的47％，但是酶的最适作用温度提高了5。C，为40℃，其余酶的突变体耐热性均 有不同程度的下降。 利用易错PCR技术，建立脂肪酶基因随机突变文库，将随机突变脂肪酶基因转 力、耐热性、耐酸性进行筛选， 最终得到六株较优突变株，摇瓶复筛后获得到突变 株ep3，所产突变脂肪酶最适pH为9．4，最适作用温度为35℃，该温度下酶的比 活为3440U／mg，比野生型重组脂肪酶高17％。 关键词：扩展青霉脂肪酶定点诱变易错PCR定向进化 中文文摘 中文文摘 脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯酯键的酶，是催化油酯水解的一类酶的总称。脂 肪酶在自然界中来源广泛，植物、动物、微生物中都可以产生脂肪酶，是最早被发 现的酶之一。微生物脂肪酶由于来源广泛，作用温度和pH范围广，底物专～性高， 是目前商业性脂肪酶的主要来源，真菌产生的脂肪酶是目前在工业和有机化学领域 应用最多的。目前许多微生物、哺乳动物的脂肪酶基因已经被克隆，部分已经在大 肠杆菌、酵母系统、米曲霉等系统实现了表达。现代生物技术的发展，使得人们可 以从分子水平对脂肪酶进行改造。 FS1 来自扩展青霉(Penicillium 884)的碱性脂肪酶是一种具有广泛应 expansum 用前景的脂肪酶，扩展青霉FSl884脂肪酶目前已经在进行工业生产，为了获得温度 稳定性和酶比活提高的突变体，经常使用诱变育种的方法得到突变体，但是传统的 诱变育种方法存在一定的局限性，针对以上原因，本课题首先获得扩展青霉脂肪酶 基因，对其脂肪酶基因进行异源表达，并对其进行分子改造。主要研究结果如下： 提取扩展青霉Penicillium FSl884总RNA，根据同一突变系谱中另一 expansum I、EcoR 菌株PF898脂肪酶序列(GenBankNO．AF284064)设计含有BamHI的引 物，反转录并扩增脂肪酶eDNA全长，双酶切并连接到表达载体pPIC3。5k当中，构 阳性克隆子后，测序验证，cDNA全长为858bp，与预期结果相符。大量提取质粒 pPIC3．5k-PEL，使用SalI线性化载体，电击转化毕赤酵母GSll5，涂布于MD平板 上，挑取转化子接种于OMM和MD平板上进行阳性克隆子的选择，并提取基因组 DNA使用PCR进行进一步确认，重组脂肪酶PEL-GS在毕赤酵母GSl15中得到成 功表达，表达量为0．6mg／ml。橄榄油乳化液平板和NaOH滴定法鉴定重组脂肪酶活 置30min后水解活力基本消失。 根据基因一致性原则选择突变位点，采用一步法对脂肪酶基因进行定点诱变， 共选择8个位点进行突变，突变体脂肪酶经电击转化毕赤酵母后均成功表达，其中 V