抗-ανβ3 cFv-sTF功能融合蛋白的可溶性表达及其特性研究.pdfVIP

抗一QvB3 scFv—sTF双功能融合蛋白的 可溶性表达及其特性研究 中文摘要 肿瘤血管靶向治疗的策略由来己久，它通过抑制肿瘤的新生血管生成来阻断 肿瘤组织养分的供给，达到抑制肿瘤的生长的目的。这种治疗方案具有毒副作用 小、不会产生抗药性、广谱性等优点。整合素家族是一类细胞粘附分子，整合素 吖p3在肿瘤血管发生和肿瘤的迁移中发挥重要的作用。整合素的单克隆抗体可 以通过竞争性占据受体和配体结合的部位，阻碍整合素和配体的结合，抑制整合 素发挥促肿瘤血管生成和肿瘤扩散的作用。组织因子是体内活性最强的凝血因子 之一，其胞外区又称为可溶性组织因子(sTF)，是凝血活性的关键部位，可溶性 组织因子可以引起肿瘤组织内的凝血反应，造成血栓，造成肿瘤的坏死。本研究 利用本室“十五863课题的研究成果——抗一伍vp3人源化抗体，研究其单链抗 体(scFv)结合肿瘤血管的能力，同时将抗一avp3与可溶性组织因子基因融合，并 在大肠杆菌中以可溶性形式表达，制备双功能的融合分子(既能阻断0rvp3的促 血管生成活性，又能诱导肿瘤血管内凝血)，为后续可能的动物实验和最终开发 出具有自主知识产权的抗肿瘤血管生成药物打下基础。 v肥眦worl(S／进行在线引物设计，输入可 首先，利用网站hnp：／／rIlail．nci亿r￡go 溶性组织因子(sTF)氨基酸序列，选择大肠杆菌偏好的密码子，设置引物的长 度为40mer，选择所需的引物复性温度为“oC，设计了34条重叠引物。采用组 装PCR的方法人工合成sTF基因。PCR产物纯化回收后克隆到pMDl8载体上 进行测序，采用DREAM技术纠正突变，最终获得了同设计的目标序列完全一 致的克隆。 同时，采用融合PCR技术，根据已经测序的人整合素avD3的人源化Fab抗 体B12克隆的序列，通过计算机软件设计了3对特异性引物分别扩增抗体的轻 链和重链基因。扩增的PCR产物纯化和回收后克隆到p旧18载体上进行测序。 序列分析表明，融合PCR技术扩增的抗人avD3的人源化scFv抗体产物与设计 的目标基因序列完全一致。 采用酶切连接的方法，分别将上述∞～和sTF基因克隆到pUCl8载体中， PCR的方法扩增∞R．sTF。PCR产物测序正确后克隆到pQE80L载体，经转化和 酶切鉴定后获得sc似sTF融合表达质粒pQE80L．sc．sTF。同时设计了互补的两 条引物，混合变性后退火获得两侧带有粘性末端的双链寡DNA接头，通过酶切方 sc知单独表 式以该DNA接头替换pQE80L．sc～．frF中的sTF序列获得了抗一伍vD3 达的质粒pQE80L．Sc向。 5感受态，挑取 将表达质粒pQE80L．sc～．sTF和pQE80L．scf；Ir分别转化M1 单菌落于新鲜氨苄LB培养基中培养，370C培养至对数生长期，加入终浓度为 分析上清和沉淀。结果表明重组蛋白主要以包涵体形式表达，但是仍有少量可溶 性蛋白表达。通过逐步减低诱导温度和IPTG浓度来提高可溶性蛋白的表达量， 在培养温度为260C、IPTG终浓度为0．04mmol几的条件下获得了较高的可溶性 蛋白表达。 由于重组蛋白带有6His标签，因此采用镍柱回收的方式回收目的蛋白。按 照镍柱纯化的说明书操作，超声后的上清经过0．45um微孔滤膜过滤后上样过柱， Tris．HCl 然后用15倍体积的结合缓冲液(20mM PH8．0，10mM咪唑，0．5MNaCD Tris．HCl 洗柱并收集过柱液；最后用洗脱缓冲液(20mM PH8．O，300mM咪唑，O．5M NaCl)过柱并收集洗脱液。SDS．PAGE分析回收的结果。采用超滤的方式将重组 蛋白的缓冲液置换为PBS缓冲液，最后用Brad旬rd蛋白定量试剂盒测量回收的 目的蛋白浓度。 采用酶联免疫吸附法(ELISA)和Wbstem bbtting的方法来验证重组蛋白和