枯草杆菌脂肪酶因分泌表达及其定点突变初步研究.pdfVIP

摘要 目的：将实验室自筛并鉴定的枯草杆菌脂肪酶(Bacillus subtili lipase,BSL)全基因lipB2 在大 肠杆菌中进行诱导分泌表达，对大肠杆菌BL21(DE3)表达脂肪酶的发酵条件进行了优 化，并运用定点突变技术对BSL 基因lipB2 第3 位、第164 位氨基酸残基进行分子突变， 以期获得高产和高活力的脂肪酶用于工业化生产。 方法： 1、利用生物信息学的方法，分析表达后的野生型和突变体枯草杆菌脂肪酶蛋白的 各种理化参数、二三级结构和活性中心相关氨基酸残基的组合状态等。为野生型和突变 体脂肪酶基因的高效表达提供良好的理论基础。 2 、利用生物信息学分析的结果，分析并设计出酶切位点引物，并通过PCR 技术获 得该脂肪酶基因全长，将其克隆到大肠杆菌pET–28a(+)表达载体上，利用枯草杆菌脂 肪酶自身的信号肽序列在E.coliBL21(DE3) 中获得分泌表达。 3、对影响枯草杆菌脂肪酶全基因lipB2 在大肠杆菌BL21(DE3) 中表达的各种发酵 条件进行优化研究，提高脂肪酶在大肠杆菌中的表达水平。 4 、通过定点突变方法对脂肪酶的第3 位、第164 位氨基酸残基进行突变，分析其 对脂肪酶酶活的影响，期望能获得酶活较高的突变株，并间接确定枯草杆菌脂肪酶酶活 的影响因子。 结果： 1、将该基因克隆到pET–28a(+)表达载体上，转化大肠杆菌BL21(DE3) ，利用枯草 杆菌脂肪酶的信号肽序列进行了分泌表达。SDS–PAGE 电泳显示分泌表达的脂肪酶分子 质量约为21KDa 。在优化的表达条件下，即温度为30℃、大肠杆菌菌液OD600 值为1.8、 乳糖诱导浓度为1.5mM、摇瓶发酵10 小时后大肠杆菌分泌表达26.0U/mL 重组脂肪酶， 相比IPTG 的诱导，既实现了脂肪酶的高效表达，又节省了成本。 2 、采用重叠延伸PCR 方法将脂肪酶第3 位编码苯丙氨酸(F)点突变为亮氨酸(L)， 第164 位天冬氨酸(D)突变为谷氨酸(E) 。将突变后的基因lip-F3L、lip-D164E 克隆到大 肠杆菌表达载体pET–28a(+) ，将构建的重组质粒pET–28a(+)-lip- F3L 转化到大肠杆菌 BL21(DE3) ，摇瓶发酵10 小时，菌液用加有底物的平板检测酶活，与野生型相比，突 变体lip-F3L 脂肪酶的分泌酶活明显提高，在橄榄油平板上形成的透明圈明显增大，而 突变体lip-D164E 的酶活也有明显提高。表明第3 位苯丙氨酸可能对脂肪酶的分泌特性 具有重要影响，而第164 位天冬氨酸替换为谷氨酸对脂肪酶的活性有明显影响，提示拉 近枯草杆菌脂肪酶活性中心催化残基之间的距离增强了它们的相互作用，进而提高了酶 活力。 结论： 1、利用枯草杆菌脂肪酶自身的信号肽序列在大肠杆菌中对该脂肪酶基因成功实现了 分泌表达。 2 、枯草杆菌脂肪酶信号肽第三位苯丙氨酸对枯草杆菌脂肪酶在大肠杆菌中的分泌表 达影响较大。活性中心特定氨基酸天冬氨酸被谷氨酸替换对脂肪酶活性的影响较明显， I 与预期结果一致，说明活性中心Asp-Ser-His 三联体之间的相互作用的强弱对酶活力具 有明显的影响。 关键词：脂肪酶基因；枯草杆菌；定点突变；大肠杆菌表达系统；分泌表达 II Abstract Objects: Secretory Expression the lipB2 lipase gene from Bacillus subtili in Escherichia coli,optimize the expression ferment condition of Bacillus subtili lipase gene.And use the site-directed mutagenesis technology to change the amino acid residue of 3th、164th. To make high yield and high viable lipase for the commercial application. Methods: 1、To draw assistance from bioinfo