甘蓝型油菜γ生酚甲基转移酶基因(BnVET4)克隆及其遗传转化的研究.pdfVIP

ENCODING MANIPULATIoNOFBnVET4 INOILSEED METHYTRANSFERASE 7-TOCOPHEROL NAPUS RAPE(BRASSICAL) By TUShiwei ADissertation to Normal Submitted University Zhejiang by Supervised Prof．JanweiPanandLixi Jiang Normal Zhejiang University Jinhua，Zhej， 一 iang，China 一， April，2012 甘蓝型油菜Y生育酚甲基转移酶基因(BnVET4)克隆 及其遗传转化的研究 摘 要 油菜，属十字花科芸苔属，主要包括白菜型油菜(Brassicacampestris)、芥菜型 主要的经济作物。随着油菜用途的不断扩大，人民需求的增加，油菜的种植面积逐年 扩增，其中甘蓝型油菜因产油量高，抗寒和抗病毒能力强且稳定性好等优点而广泛种 植于世界各地。 近年来，随着分子生物技术的快速发展，作物的转基因研究及应用已成为研究热 点，其中，油料作物油菜的转基因育种研究是较为活跃的领域之一。目前，人们己成 功建立了以油菜子叶柄、下胚轴、茎段、原生质体和小孢子培养等为受体的遗传转化 体系，转化方法有农杆菌介导法、基因枪法、PEG介导法、电击穿孔法、激光微束 穿刺法、显微注射法、花粉管介导法和花序浸泡法等。主要涉及油菜的品质改良、抗 病、抗逆、不育基因等方面的应用。 油菜含有丰富的维生素E，它是一种脂溶性抗氧化剂，维生素E在人的正常生长、 生育过程中起重要作用，能降低人心血管疾病和癌症的发生、提高人体免疫力、延缓 人体衰老；生育酚在信号传导途径及转录过程中也扮演重要的角色；0生育酚有助于 保证叶绿体氧化还原能力，维持类囊体结构和功能以及响应逆境胁迫。 Q生育酚是维生素E中活性及价值最高的组分，但其含量非常低，人工合成Q生 育酚的活性只有天然的一半，且成本较高。因此，本实验通过从油菜中克隆BnVET4 基因，其功能是合成1，生育酚甲基转移酶，催化Q生育酚合成。构建BnVET4基因双 元超表达载体，并转化油菜，实现油菜种子中0生育酚含量的提高。 基于对Q生育酚合成途径的了解，本研究设计以下实验路线，取得较理想的结果。 1．BnVET4基因克隆。通过对数据库NCBI检索，获得Y生育酚甲基转移酶基因 BnaA。VTE4．al CDS序列，设计引物，以甘蓝型油菜浙双72叶片cDNA为模 板，克隆到曰，z陋Ⅳ基因，编码序列全长1044 bp，与Genebank中已发表的 VTE4序列同源性达99％。 2．双元超表达载体构建。利用限制性内切酶Xba 和基因BnVET4进行双酶切，连接后转化大肠杆菌感受态细胞，经筛选及验证， 转化农杆菌LBA4404菌株，一800C保存备用。 3．油菜遗