砀山酥梨果实PL酶学特性的研究及PAL基因克隆.pdfVIP

嬲煳必 ． 捅 要 bretschneideri 砀山酥梨(Pyrus cv．)原产安徽省砀山县，是我国梨的主栽品种 和主要出口品种之一。但是由于近年来管理不善、品种退化等原因，使得石细胞 含量明显增加，肉质变粗、多渣，口感变差，严重降低了砀山酥梨的品质及其经 济价值。因此，通过生物学等手段降低石细胞含量，提高砀山酥梨品质，以增强 砀山酥梨市场竞争力成为亟待解决的问题。本实验以砀山酥梨果实为材料，研究 砀山酥梨果实发育过程中石细胞含量、木质素含量及木质素合成关键酶苯丙氨酸 解氨酶(PAL)活性变化，找到梨石细胞发育与PAL的关系。并对PAL的酶学特性 进行研究，以期了解梨PAL的性质，同时克隆以三基因，为从生理生化及分子生 物学水平调控砀山酥梨石细胞发育提供理论基础，主要研究结果如下： 1、通过对五种梨果实切片观察发现砀山酥梨、贡梨和丰水梨石细胞团较大， 分布较密集；砀山酥梨石细胞团最大，分布最密集；库尔勒香梨石细胞团较小， 分布较疏散。苹果梨，石细胞团最小，分布最疏散。 2、在砀山酥梨果实整个发育过程中，石细胞含量于花后51天出现高峰， 高峰值为17．83％；木质素含量于花后47天和花后63出现两个高峰，峰值分别 为6．47％和7．00％；PAL活性最大值出现在花后27天，最大值为85．53 u／g·h。 三者高峰期的出现在时间上表现出一定的时序性，PAL活性的高峰期最先出现， 然后木质素含量出现高峰期，石细胞含量的高峰期最后出现。它们三者的变化 趋势基本相同，总体上均呈先升高后下降的趋势，且三者之间均呈显著正相关。 3、砀山酥梨果实PAL的最适pH为9．2；在pH9．0左右时稳定性较高：用 pH4．0和pHlO．0的缓冲液处理均导致酶分子结构发生变化，活性降低；PAL最 适反应温度为60℃左右，较耐热；当反应时间在180min内PAL的活性与反应 时间里线性关系；PAL对L．苯丙氨酸有较高的专一性，对L一酪氨酸也表现出一 mmol／L。 有两个，Kml为0．7500mmol／L，Km2为1．0690 4、克隆得到砀山酥梨果实PAL基因eDNA片段长度为585bp，推断编码 195个氨基酸序列。该序列包含与其它植物PAL相同的活性催化位点，经序列 分析和同源性比对，该氨基酸序列与其它植物PAL氨基酸序列的同源性在90％ 以上。系统进化树分析表明，砀山酥梨PAL氨基酸序列与蔷薇科的甜樱桃PAL 氨基酸序列聚类关系最近。 关键词：砀山酥梨果实；石细胞；木质素；PAL；酶学特性；RT-PCR；序列 分析 ’ ■ PAL The ofPALCharacterizationand Gene Study Cloning in bretschneideriCV． P妙／／S Abstract bretschneideriin isone Province，which Pyrus cv．originatesDangshan,Anhui ofthe formain and to pear cultivatingexporting．However,duepoor products