硝基还原假单胞谷氨酰胺酶基因的克隆、表达及其在L-茶氨酸酶法合成中的应用.pdfVIP

摘要 摘要 L．茶氨酸(L．111eaniIle)是一种茶叶中特有的氨基酸，也是茶叶的主要呈味 物质。近年来的很多研究结果证实茶氨酸具有许多有益的生理功能，例如：保护 神经、降低血压、抗肿瘤、放松等。因此，茶氨酸的制备与应用受到越来越多人 3．5．1．2)， 的关注，成为了一个研究热点。谷氨酰胺酶(gllltamjnaSe，GLS；EC 是催化L．谷氨酰胺水解成为L．谷氨酸和氨的水解酶。有研究表明某些谷氨酰胺 酶在碱性条件下，可以像丫一谷氨酰转肽酶(丫一G1u：taInyl觚唧e皿dause，丫一GC玎； EC 2．3．2．2)一样催化L一谷氨酰胺和乙胺合成茶氨酸。由于以往的茶氨酸制备方 法存在诸如产率低或副产物多的问题，而研究运用谷氨酰胺酶合成茶氨酸能改善 这两个难题。本研究的主要结果如下： 1、本实验首次克隆了硝基还原假单胞茵(AP积伽on铘力豇rD似妇e珊)的谷氨酰胺 bp，编码302个氨基酸。通过 酶(pnGLS)基因序列。pnGLS基因全长909 氨基酸序列分析，pnGLS与同属的恶臭假单胞菌(尸．倒眈扬F1)、铜绿假单 系也比较相近。同时，得到的氨基酸序列还具有p．内酰胺酶和青霉素结合蛋 ．白超家族所特有的几个保守的关键性催化位点，进一步证明是硼lGLS基因。 2、根据获得的序列，设计带酶切位点的专一性引物，PCR扩增基因片段，再连 到EcD矗BL21中，构建重组菌。 3、优化了重组菌的表达条件，在起始菌液浓度OD600为0．6时，加入诱导剂1g／L KDa，占到全 h。表达的重组蛋白分子量约99 乳糖在24℃、180Ipm诱导10 蛋白可溶性很好，几乎不含包涵体。 4、运用重组菌粗酶液催化L-谷氨酰胺和乙胺生成茶氨酸，优化了反应条件。5 M乙胺、1．5 10．O，在 mL体系中，0．3M谷氨酰胺、1．5 U怕n。fcr粗酶液、pH 37℃反应5h，茶氨酸合成量达到最高，谷氨酰胺的转化率约为40％。为今后 进一步构建谷氨酰胺酶工程菌生产茶氨酸提供了依据，也为茶氨酸工业化生 产提供广阔前景。 关键词：谷氨酰胺酶，硝基还原假单胞菌，丫．谷氨酰基转移反应，茶氨酸 ‘ Abs缸act AbStraCt L-The痂eis acidandt11e a吡que础o m旬or oft11etea． uma血component recent Many rese盯cheshayereVealed也attheaIl逾e lotsof possesedphysiological 舢1ctionssuch asneuroproteCtion， bIood—pressurereduction，觚titumor activi吼 rel觚ationandso a11dmore a位e血onhaSbeen to on．Therefore，more