米曲氨基酰化酶的提取及其酶学性质的表征.pdfVIP

维普资讯 米曲氨基酰化酶的提取及其酶学性质的表征 钟 琦 关怡新 姚善泾 (浙江大学化学工程与生物工程学系，杭州，310027) 摘 要 通过硫酸铵分级沉淀、SephadexG50凝胶层析和DEAE—Sepharose阴离子交换层析，从米 曲霉3042中提取得到了米曲氨基酰化酶，该酶的纯化倍数为54．29，比活为647．66U／mg，总收率 为49．53％。详细考察了温度、pH、缓冲体系的离子强度和金属离子对米曲氨基酰化酶酶活的影 响。结果表明，该酶促反应的最适pH为7．5～8．0，最适反应温度随催化反应时间的延长而降低， 缓冲体系中的离子对酶活有抑制作用，而低浓度的Co2对酶活有激活作用。 关键词 米曲氨基酰化酶，纯化，酶学性质 在单一构型氨基酸的生产中，以往手性拆 (Pseudomonasmaltophila)等微生物中提取得 分的目的只是为了得到L构型的异构体，而将 到，其中以米曲霉固态发酵产生的胞外酶最易 D构型异构体经外消旋后重新进入拆分步骤。 获得，也最适合工业应用。文中拟在米曲霉固 由于一次拆分的理论收率不超过50％，因而限 态发酵的基础上对其进行纯化，并对该酶的酶 制了该方法的大规模应用。最近的研究表明， 学性质进行表征，为将其用于手性氨基酸的拆 很多氨基酸2种构型异构体都有价值，例如D一 分打下基础。 色氨酸[·、D一丙氨酸[]和D_苯丙氨酸[]等非 1 材料及方法 天然构型D_氨基酸在医药、食品以及饲料等行 业中都具有较好的潜在价值。因为D一氨基酸 1．1 仪器和试剂 无法通过发酵法获得，因而手性拆分就显示出 AKTAExplorer100纯化系统、Biochrom 它高效、产品分离纯化简便的优点。其中条件 Ultrospec3300紫Jb／可见光分光光度计，购自 温和、效率高、绿色环保的氨基酰化酶法拆分则 瑞典AmershamBiosciences；UNIVERSAL32R 是同时获取2种构型氨基酸的最佳方法之一。 高速冷冻离心机，Hettich公司产品；DF—IO1S 氨基酰化酶[EC3．5．1．14]是一类能专一 集热式恒温加热磁力搅拌器，河南巩义市英峪 水解N一酰基一L一氨基酸的酰胺键的酶。由于这 予华仪器厂。蛋氨酸 (L—Methionine)，纯度 种立体专一性，它很早就被用来拆分DL一氨基 99．5％，上海生工分装；N—Acetyl—DL—methion— 酸。氨基酰化酶的来源很广，存在于各种动物 ine，纯度99％，LancasterSynthesis；其余试剂均 和植物器官、微生物体内及其发酵液中。微生 为国产分析纯。 物中的氨基酰化酶是工业应用最直接和最便利 1．2 菌 种 的来源。迄今为止，已经在米曲霉菌[](As— 米曲霉 3042(Aspergillusoryzae3042)由 pergillusoryzae)、葡酒色青霉菌 6【(Penicilli— 浙江省微生物研究所提供，经本实验室筛选后 Umvinaceum)、产碱杆菌 7【(Alcaligenssp．)、 使用。4℃下保藏，每3个月转接1次。 芽孢杆菌8【．9(Bacillussp．)、阿拉伯乳酸杆 1．3 培养基 菌[加(Lactobafillusarabinoss)、分枝杆菌[¨] 斜面培养基(g／L)：葡萄糖40．0，胰蛋白胨 (Mycobacterium sp．)、嗜麦芽假单胞菌 1【] 20．0，酵母抽提物 3．0，MgSO41．0，K2HP04 第一作者：硕士研究生(姚善泾教授为本文通讯作者)。 *国家自然科学基金资助项 目(N0 收稿时间：2003—09—25 (36) 维普资讯 2．0