《棉花GhMDH基因的克隆及其蛋白诱导和酶活性分析》.pdfVIP

● C T - IIBRICULTURAE 华北农学报 ·2013，28(4)：13-18 BOREALI-SlfllC| 棉花 GhMDH基因的克隆及其蛋白诱导和酶活性分析 李 青 ，张 宁 ，司怀军 ，吴家和 (1．甘肃农业大学，甘肃省作物遗传改 良与种质创新重点实验室，甘肃 兰州 730070； 2．中国科学院 微生物研 究所 ，植物基因组学国家重点实验室 。北京 100101) 摘要：分析棉花盐胁迫相关的EST文库，设计特异性引物，利用 RACE技术从棉花中克隆出苹果酸脱氢酶 (Malate dehydrogenase，MDH)基因，命名为GhMDH。基因全长 1130bp，最大开放阅读框 1014bp，编码 338个氨基酸，分子量 为 35．495kDa，等电点pI=8．94。将该基因编码区插入到原核表达载体 pET23b中，获得 pET23b—GhMDH重组载体。 利用 IPTG诱导表达 目标蛋 白，发现通常条件下获得的重组蛋 白以包涵体的形式存在。对诱导时间、IPTG浓度和温度 等条件进行优化 ，结果表明，除了在 28℃低温 以下诱导的蛋 白有少量为可溶，其他条件诱导的蛋 白均 以包涵体形式 存在。为了得到足够的重组蛋 白，对 GhMDH包涵体蛋白采用脲素缓冲液溶解 ，对提取液进行镍亲和层析柱纯化，对 洗脱的产物经脲素梯度透析复性。利用生化测定法测定 目标蛋 白的酶活性 ，结果表 明，克隆的GhMDH基因编码蛋 白酶 具有脱氢酶活性。以上结果为GhMDH在棉花体 内氧化还原动态以及参与抗逆功能等研究提供前提条件。 关键词：棉花；苹果酸脱氢酶；基因克隆；诱导表达；包涵体 中图分类号：Q78 文献标识码 ：A 文章编号：1000—7091(2013)04～0013—06 CloningandProteinExpressionofM alateDehydrOgenaseGeneof Gossypium hirsuturm L．andItsEnzymeActivityAnalysis LIQing ，ZHANGNing，sIHuai．jun，WUJia．he (1．GansuKeyLaboratoryofCropGeneticandGermplasmEnhancement，GansuAgriculturalUniversity， Lanzhou 730070，China；2．StateKeyLaboratory ofPlantGenomic，InstituteofMicrobiology，Chinese AcademyofSciences，Beijing 100101，China) Abstract：Accordingtothesaltstress—relatedEST sequencesofGossypium hirsuturm L．，amalatedehydrogen— ase(MDH)genewasisolatedbythe3，5 RACEtechnology，namedGhMDH．Thefull—lengthcDNAofGhMDHis 1130bp，containinga1014 bpORF which encodes338aminoacids．Therelative molecularweightofGhMDH proteinis35．495kDa，anditsisoelectricpoint(pI)is8．94．TheGhMDHORFhadbeensubclonedintopET23b vectorforgeneratingaHis-tagfusionrecombinantprotein．Theinducibleconditionsofrecombinantproteinexpres— sionwasoptimized，includingIPTG contend，temperatureandtime．Theresultsshowed thatthetargetproteinwas packagedininclusionbodyexpressedunder37 ℃ ．1mmol／LIPTG and4 hrsinductio