人参炔三醇对CYP3A介导的咪达唑仑不同羟化代谢影响的机制的研究.pdfVIP

摘要 摘要 背景： 前期通过固相萃取、色谱逐级分离、波谱分析及结构鉴定等多种技术手段， 影响的物质，即抑制其4．羟化代谢，而激活其1’．羟化代谢。本课题通过大鼠肝 微粒、人肝微粒体及大鼠原代肝细胞代谢模型，探讨PXT对CYP3A介导的MDZ 不同羟化代谢通路影响的机制。 目的： 通过肝微粒体体外代谢方法从酶多结合位点角度分析人参炔三醇对CYP3A 酶动力学的影响；并通过测定大鼠原代肝细胞中CYP3A探针底物咪达唑仑不同 羟化代谢情况，反应人参炔三醇对CYP3A酶活性的影响；最后RT．PCR实验测 定CYP3A1／2mRNA的表达情况，综合分析人参炔三醇对CYP3A介导的MDZ 不同羟化代谢通路的影响机制，为临床安全合理用药提供科学依据。 方法： l、PXT对大鼠及人肝微粒体中CYP3A介导的MDZ羟化代谢影响。 ①建立咪达唑仑在大鼠及人肝微粒体中的孵育方法及样品处理方法。建立温孵 体系中咪达唑仑4．羟化及l’．羟化代谢产物的HPLC检测方法。 ②分析不同浓度人参炔三醇(0、1、4、8肛幽柚)对肝微粒体中咪达唑仑不同 羟化代谢酶促反应动力学参数的影响(Km、Vm跗CLint)。 2、PXT对大鼠原代肝细胞中CYP3A介导的MDZ羟化代谢影响。 ①建立大鼠原代肝细胞的分离及纯化方法。通过台盼蓝排斥实验测定肝细胞的 活性及产率，运用光学显微镜观察肝细胞的显微结构。通过MTI实验测定MDZ、 检测方法。分别从培养时间、肝细胞接种密度、底物浓度三个方面考察MDZ在大 鼠原代肝细胞中年羟化及1’．羟化代谢的酶促动力学特征。 分别培养45min、4h、6h后，对MDZ4．羟化及l，-羟化代谢的影响。 摘要 3、PXT对大鼠原代肝细胞中CYP3A1／2mRNA表达的影响。 鼠原代肝细胞中CYP3A1／2mRNA表达的影响。 结果： 1、PXT对大鼠及人肝微粒体中CYP3A介导的MDZ羟化代谢影响。 法，符合分析检测要求。 ②PxT抑制肝微粒体中MDZ的4．羟化代谢，激活其l’．羟化代谢。在RLM 中，PXT浓度分别为0、1、4、8 0．72 nmol／min．mgpro逐渐减小至0．51nmol／min．mgpro，Km由5．12州逐渐增加 至7．26 pM。CLint=Vm。涨m，CLi。t由0．14逐渐减小至0．07ml／min．mgpro， 4-OH．MDZ的酶动力学参数在HLM中也呈现相同的趋势。通过双位点模型求算 RLM中I-OH．MDZ酶动力学参数Vm毅l由O．38增加至O．84 nmol／min．rngpro， Kml由8．9降低至5．4rtM，CLint(Vmaxl依m1)由O．04增加至O．16 ml／min．mgpro， 在HLM中PXT对MDZ的l’一羟化代谢表现出相同的激活效果。 2、PXT对大鼠原代肝细胞中CYP3A介导的MDZ羟化代谢影响。 ①建立了成熟稳定的大鼠原代肝细胞分离方法，肝细胞活力较高达85％，产 率为(0．4．0．8)X 108／肝。建立了快速有效的肝细胞样品中4-OH．MDZ及 1．O．40．0 pM，0．5．20p,g／ml范围内对肝细胞毒性较小。培养时间为0．120min，肝 细胞接种密度为(0．75—3．0)x 及17．OH．MDZ代谢产物基本呈线性增加；MDZ浓度达到10州时，4．羟化及1，． 羟化代谢产物近似达到饱和，符合经典的酶动力学特征。 ②与肝微粒体实验结果一致，PXT(O、1、4、8 rtg／rra)与MDZ在大鼠原代 肝细胞中共同培养45min后，对MDZ的不同羟化代谢产生差异作用，即抑制其 4．OH代谢，激活其l’．羟化代谢。随着培养时间的延长，PXT对咪达唑仑4一羟化 代谢的抑制作用增强，并且对l’．羟化代谢也表现出抑制作用，PXT(1、4、8