共表达dll4，p16基因真核表达载体构建及其对白血病细胞K562的影响.pdf

共表达dll4，p16 基因真核表达载体构建 及对白血病细胞K562 的影响 摘 要 目的：本文构建真核基因双表达载体 pBudCE4.1-dll4-16 ，并将构建的真核双表 达载体通过Lipofectamine 2000 转染慢性粒细胞白血病细胞株K562 ，观察目的 基因在白血病细胞株K562 中的表达情况，进而研究其对白血病细胞增殖情况的 抑制作用，为进一步研究多种基因同时用于肿瘤治疗奠定一定基础。 方法：本文构建真核双表达载体 pBudCE4.1-dll4-16 ，该载体包含野生型 dll4cDNA 、p16cDNA 基因，同时构建对照组质粒 pBudCE4.1-dll4 、 pBudCE4.1-16 。通过脂质体法将各组质粒转染入白血病细胞K562 中，分为三阶 段：一是转染48 小时后，收集各组细胞，用RIPA 裂解细胞，免疫印迹法检测 外源性目的基因瞬时转染的表达水平；二是通过Cell Counting Kit-8(CCK-8),描 绘各试验组细胞的生长曲线；三是转染48 小时后，经70%预冷乙醇固定，PI 染 色后，通过流式细胞仪检测各试验组细胞的周期分布情况。 结果：本实验成功构建了真核表达载体pBudCE4.1-dll4 、pBudCE4.1-16 及真核 双表达载体 pBudCE4.1-dll4-16 ，通过限制性核酸内切酶酶切方法鉴定插入基因 的位点与预期相符。通过脂质体法将各组质粒成功转染入白血病细胞株K562 中， 转染后48 小时，采用免疫印迹技术检测到野生型dll4、p16 基因在白血病细胞 K562 中的表达水平：实验组（质粒pBudCE4.1-dll4-16 转染组）和对照组1 （质 粒pBudCE4.1-16 转染组）细胞均表达P16 蛋白，其余三组均不表达；实验组（质 粒pBudCE4.1-dll4-16 转染组）及对照组2 （质粒pBudCE4.1-dll4 转染组）细胞 均高度表达dll4 蛋白，其余三组均中度表达。转染48 小时后，通过PI 染色处 理，经流式细胞仪检测各组细胞的细胞周期分布情况，相比较于对照组，实验组 细胞G0/G1 期增多，差异有显著统计学意义（P0.001 ）。细胞生长曲线显示，细 胞生长受到明显抑制，尤其是实验组细胞。 结论：重组的双表达质粒pBudCE4.1-dll4-16 能在白血病细胞K562 中共同表达 目的基因，诱导细胞周期停滞于G0/G1 期，抑制细胞生长，但不诱导细胞凋亡。 关键词: dll4 基因 p16 基因 pBudCE4.1 质粒构建 基因转染 共表达 周期 4 Construction of Recombinant Plasmid pBudCE4.1-dll4-16 and its Effect on Leukemic Cells K562 Abstract Objective ：This article constructs a vector containing human suppressor gene dll4 and INK4a INK4a p16 , uses the Lipofectamine 2000 to dry the dll4 and p16 into the Leukemic cell line K562,and observing its expression and function in Leukemic cells.To further study many kinds of genes to use in the tumor treatment laying the foundation. Methods ：Recombinant plasmid pBudCE4.