骨形态形成蛋白4对大鼠远端肺动脉平滑肌细胞内钙离子浓度影响及机制初步的研究.pdfVIP

骨形态形成蛋白4 对大鼠远端肺动脉平滑肌细胞内钙离子浓度影响及其机制初步研究 骨形态形成蛋白4 对大鼠远端肺动脉平滑肌细胞内 钙离子浓度影响及其机制初步研究 博士研究生：李晓岩 导 师：冉丕鑫 教授 王 健 教授 中文摘要 目的： 探讨骨形态形成蛋白 4（BMP4）对大鼠远端肺动脉平滑肌细胞内钙离子浓 度的影响及其机制，为进一步探究其在低氧性肺动脉高压（HPH）发病过程的可 能作用与机制打下基础。 研究内容和方法： 一、BMP4 对大鼠远端肺动脉平滑肌细胞内钙离子浓度的影响 将200-300g雄性Wistar大鼠麻醉后,取出心肺组织,置于显微镜下，用显微镊 和显微剪刀于显微镜下小心分离出远端(4-5级)肺动脉,剥离内外膜后,采用胶原 酶消化法获得远端肺动脉平滑肌细胞,将细胞种于放置在35mm培养皿内的圆形载 玻片上,培养至第三天细胞密度达到50%,将细胞随机分为三个组:(1)未处理组, 未给予刺激物; (2)对照组,用等量的BMP4溶解缓冲液处理PASMCs 60h; (3)BMP4 组,用BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h。细胞用Fura-2在细胞培养箱内孵育1h，使 2+ Fura-2进入细胞内，用荧光显微镜检测，根据标准曲线，推算细胞内Ca 浓度。 3 骨形态形成蛋白4 对大鼠远端肺动脉平滑肌细胞内钙离子浓度影响及其机制初步研究 二、BMP4 影响大鼠远端肺动脉平滑肌细胞 TRPC1,6 mRNA 和蛋白质表达及其机 理研究 1、BMP4 对PSMC 表达TRPC1、6 mRNA 和蛋白质的影响：实验采用原代培养 大鼠远端肺动脉平滑肌细胞，培养至第五天细胞密度达到 80-90%,将细胞随机 分为三个组:(1)未处理组,未给予刺激物；(2)对照组,用等量的BMP4 溶解缓冲 液处理PASMCs 60h；(3)BMP4组,用BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h。收集细胞， 用 iQ SYBR Green supermix试剂实时定量细胞中的TRPC1,6 mRNA 的表达；用 Western Blotting 检测TRPC1,6 蛋白质的表达。 2、BMP4 对 Smad1/5/8 ，ERK1/2, p38MAPK 信号通路的影响：原代培养大 鼠远端肺动脉平滑肌细胞，培养至第五天细胞密度达到 80-90%,将细胞随机分 为七个组:(1) 对照组,用等量的 BMP4 溶解缓冲液处理 PASMCs15min； (2)BMP4(50ng/ml)处理组: 分别用BMP4(50ng/ml)处理 PASMCs15min、30min、 1h、4h、8h、60h。收集细胞，用Western Blotting 检测BMP4 对Smad1/5/8 ， ERK1/2, p38MAPK 信号通路的影响。 3、BMPRⅡSiRNA、SB 及PD 对BMP4/Smad1/5/8 ，ERK1/2, p38MAPK 信号通 路的影响：用 Western Blotting 检测 BMPRⅡ-SiRNA、PD 和 SB 对 BMP4 刺激 Smad1/5/8 、ERK1/2 和p38MAPK 信号通路的影响。 4、SB 及PD 对BMP4 促进大鼠远端PSMCs 表达TPRC1,6mRNA 和蛋白质的干 预作用：原代培养大鼠远端肺动脉平滑肌细胞，培养至第五天细胞密度达到 80-90%,将细胞随机分为四个组:(1) 空白对照组，细胞未给予任何刺激物；(2) DMS0 对照组, DMSO 预处理细胞30min, BMP4(50ng/ml)处理PASMCs60h； (3)SB 组，SB(5μM)预处理细胞 30min, BMP4(50ng/ml)处理 PASMCs60h；(4)PD组， PD(10μM)预处理细胞 30min, BMP4(50ng/ml)处理 PASMCs60h；收集细胞，用 iQ SYBR Green supermix 试剂实时定量细胞中的 TRPC1,6 mRNA 的