骨髓源肝干细胞的克隆化及生物学特性研究.pdf

骨髓源肝干细胞的克隆化及其生物学特性的研究 骨髓源肝干细胞的克隆化及其生物学特性的研究 专 业： 病理学 硕士研究生； 陈少红 导 师： 赵国强教授 摘要 于细胞是指具有自我复制能力和分化潜能的细胞。通常将干细胞分为两大类 型：胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞是指来源于囊胚期内细胞团的细胞， 这些细胞具有多分化潜能，几乎可以分化为机体任何类型的细胞。成体干细胞则 是指分布于成体组织或器官内的干细胞，这种干细胞也具有向一个或多个方向分 化的潜能。 骨髓是成体于细胞最多的细胞库。骨髓细胞其主要包括两大类细胞。一类是 造血细胞，包括少量的造血干细胞、造血祖细胞和不同发育阶段的血细胞；另一 类是骨髓基质细胞，包括网状细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、脂肪细胞和血窦内 皮细胞等。一般认为，骨髓基质细胞不仅参与骨髓网状组织的构成，对造血细胞 起支持作用，而且通过细胞间的相互接触和多种体液因子及粘附分子的作用，调 节造血细胞的增殖、分化和成熟。但研究表明骨髓基质细胞中还存在着具有多向 分化的潜能的细胞群，被称为骨髓问质干细胞(BMScs)。其在一定的条件下可 向三个胚层的细胞分化，例如骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞，骨骼肌细胞、心 肌细胞、内皮细胞，神经原和肝细胞等。 大部分从大鼠股骨和胫骨中取得的BMSCs都是通过贴壁法而获得，但是贴 壁的细胞除了MSCs之外，还有贴壁的吞噬细胞、内皮细胞、淋巴细胞和平滑肌 细胞，使得培养的MSCs的在形态上具有多样性。MSCs不但在大小，形态上， 而且在分化潜能和扩展能力方面也很不一致。各种分离和纯化，富集MSCs的方 法已经迅速发展，如免疫磁珠和流式技术，但至今，人们还仍然没法确定用这些 骨髓源肝干细胞的克隆化及其生物学特性的研究 方法富集的细胞是不是一致性的。因为没有一种或一组联合抗体对MSCs是特异 性的。即使现今报道的非常纯化的群体由于在传代中分化祖细胞，即过渡细胞的 产生，使得这种纯化的细胞群体也异质化。而且，随着传代，某些MSCs会保留 其多向分化潜能，但也有一些要么只能朝某个特定方向分化，要么开始衰老死亡。 因此，成体干细胞在体外传代和扩增的困难极大地限制了它们的应用。很明显， 在l临床广泛应用之前，必须要建立一种在体外大量扩展MSCs，但又不能影响其 分化潜能的方法。我们基于非平衡细胞动力学的抑甫0(SACK)N论，应用了一种 新的方法去建立成体干细胞株(系)并在体外培养扩增。非平衡细胞动力学对于 成体干细胞保持其在体内的功能是必需的，却是体外扩增的阻力，因此，从非平 衡细胞动力学向平衡细胞动力学的转变将促使成体干细胞的指数增殖并保持其 在体外长期传代的稳定性。黄苷(xs)便充当了这种角色。 在前期工作中，我们以2-AAF／CCl4程序构建急性肝损伤动物模型，取损伤 后的肝脏萃取物作为骨髓间质干细胞的实验组刺激物进行诱导培养，用RT-PCR 技术检测细胞分子表面标志的变化。结果显示：实验组BMSCs诱导至1ld表达 幼稚肝细胞标志M2一PK、GST-P，而对照组诱导的骨髓间充质干细胞无此改变， 这说明损伤的肝脏能够产生某种因子，可以激活干细胞向肝细胞方向的分化。那 么，本实验所得到的单细胞克隆能否对这些因子产生应答反应了?通过这种诱导 的方法，我们可以筛选出能够向肝细胞方向分化的干细胞。 实验方法： 1、利用贴壁法分离培养原代雄性大鼠骨髓间质干细胞，培液中含400Xs laM 和1ng／mlEGF， 2、再高度稀释这种混合细胞并以单细胞接种于96孔板。记录并培养扩增单 细胞的克隆。 3、采用3％2．AAF／CCl4急性肝损伤模型雌性SD大鼠的肝组织匀浆诱导这些 单细胞克隆，取诱导第十一天和第二十天细胞，R11-PCR检测BST-l、GST-P、 M2．PK及AlbmninmRNA的表达；同时用正常同种雌性大鼠肝匀浆作对照培养。 4、对比培养细胞，优化细胞培养方法。 结果： l、得到14株单细胞克隆，记为c1、c2、c3……C14等；