缺氧诱导因子-1在肺癌中的相关性的研究.pdf

驳嵘溥分笋越全老丈 缺氧诱导因子一1在肺癌中的相关性研究 全文摘要 缺氧是肿瘤细胞生长的基本环境，肿瘤细胞如何适应这一微环境并保持持续 生长己成为肿瘤研究中的中心问题。缺氧诱导因子·I(Hypoxiainduciblefactor-1, HIF-I)首先是在 1992年作为被缺氧诱导，连接在 EPO基因缺氧反应元件 (Hypoxiaresponseelement,FIRE)上的一个核因子被发现。HIF-i是由a.R两个 亚单位形成的二聚体，其中HIF-1o.受缺氧的调节，它通过与靶基因特定序列DNA 结合而调控它们的转录。这些基因包括血管内皮生长因子(VEGF)、促红细胞生 成素 (EPO)、糖酵解相关酶等基因。这在肿瘤，尤其是乏氧肿瘤 (如肺癌)的 发病及疾病的发展中起着重要的作用，它们能使肿瘤更具有侵袭性，容易发生远 处转移。肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，目前，有关HIF-Ia与肺癌的相关 性报道不多，本研究拟从这方面着手，为肺癌的基因治疗寻找一条可行的途径。 一、HIF-Ia在人肺癌中的表达及与P53和VEGF的相关性 方法 以SP免疫组化法检测肺癌组织中HIF-la.P53和VEGF的表达情况。 结果HIF-I(x在肺癌总阳性表达率为63% (36/57)，其中以细支气管一肺泡癌表达 阳性率最高 (86%)。且HIF-Ice表达与P53及VEGF呈明显正相关 (P0.05). 结论 HIF-I。在肺癌中高表达，且与P53及VEGF明显相关。 二、重组表达质粒pcDNA3/HIF-Ia的构建及其在人肺癌细胞株A549的稳定表达 方法 采用RTPCR方法扩增肺癌细胞株A549内HIF-la基因功能区片段，克隆 至真核表达载体pcDNA3上，转染A549细胞后，经G418筛选，建立稳定表达 医.凳嵘厚-f李;夕ip戈. HIF-1“基因的细胞株，Western-blot分析HIF-la蛋白的表达。 结果通过酶切鉴定，经凝胶电泳分析，两条带大小分别位于5.3kb和2.55k6, 与预期结果符合。经脂质体包裹转染A549后，Western-blot分析证实HIF-Ia蛋 白的表达明显上调。 结论 经脂质体途径成功构建稳定表达HIF-1。的细胞模型，为肺癌研究提供了一 个有效的工具。 三、转染缺氧诱导因子.Ia对肺癌细胞A549生长的影响 方法将HIF-la转染人肺癌细胞A549中，观察A549细胞生长。建立人肺癌裸鼠模 型，随机将其分为两组:对照组 (A组，10只)，HIF-1。转染细胞组 (B组，10 只)。2月后，切除瘤灶、称瘤重、计算促瘤率。标本用免疫组化测定增殖细胞核 抗原 (PCNA)，同时用Westem-blot检测HIF-la,凋亡抑制蛋白survivin和bcl-2的 表达。 结果HIF-la转染A549细胞后，细胞生长速率加快。转染HIF-1a的裸鼠肿瘤生长 较对照组快，A组、B组的瘤重分别为2.5110.338.3.44to.40g，促瘤率为37%. 免疫组化和Western-blot提示:B组的PCNA表达比A组高，B组HIF-la,survivin, bcl一的蛋白水平明显高于A组。 结论转染HIF-la体内、外均可促进肺癌A549细胞的生长，其机制可能与其能促 进细胞恶性增殖和抑制凋亡有关。 四、缺氧诱导因子.la增加化疗药物耐受性的研究 方法将HIF-I。转染人肺癌细胞A549中，Westem-blot检测转染前后多药耐药蛋 白(mdrl)的表达变化。加入化疗药物5-Fu(0.1mg/mL)，用生长曲线观察A549 细胞的生长情况，用流式细胞仪检测细胞凋亡指数，用 Western-blot检测 华中fp友犬李周MW=3P}A博士=9舫龙戈 caspase3的活性变化。 结果转染HIF-1a后，mdrl表达上调。转染HIF-la组的细胞凋亡抑制、凋亡指 数、caspase3的活性均低于单独加5-Fu组。 结论HIF-1a能够增加肺癌细胞A549凋亡的阐值和上调mdrl的表达，从而增加 细胞对化疗药物的耐受性。 五、缺氧诱导因子一la反义寡核昔酸对肺癌细胞生长和致瘤能力的抑制作用 方法