《青霉素酰化酶交联酶聚体的制备及热失活动力学-论文》.pdfVIP

V01．35 高等 学校 化 学 学报 No．6 2014年 6月 CHEMICALJOURNALOFCHINESE UNⅣ ERSITIES 12l2～12l8 青霉素酰化酶交联酶聚体的制备及热失活动力学 慕洋洋 ，甄倩楠 ，王梦凡 ，齐 崴 ，苏荣欣 ，何志敏 (1．天津大学化工学院，化学工程联合国家重点实验室，2．食品工程系，天津 300072) 摘要 以0．53g／mL硫酸铵为沉淀剂 ，0．35％(体积分数)戊二醛为交联剂制得青霉素酰化酶交联酶聚体 (CLEAs)，酶活收率 30．1％，其最适温度(57℃)比游离酶提高 10℃，最适 pH(10．0)向碱性偏移 1．7个单 位．对比游离酶及其CLEAs的热稳定性和热失活动力学模型发现，游离青霉素酰化酶制成CLEAs后 ，其热 失活动力学模型由一步失活转变为连 串失活，失活反应活化能 由248．8kJ／mol增加至549．2kJ／mol，对 CLEAs热稳定性大幅提高的原因进行了解释．CLEAs重复利用7次后 ，酶活保留56％以上，具有 良好的重复 利用性． 关键词 交联酶聚体 ；青霉素酰化酶；固定化 ；稳定性；热失活动力学 中图分类号 0629．8；Q814．2 文献标志码 A 青霉素酰化酶(Penicillinacylase，E．C．3．5．1．11)¨是生产半合成抗生素的关键酶，可催化青霉 素和头孢菌素发生脱酰反应，生成JB一内酰胺类抗生素 (青霉素类和头孢菌素类)的母核6．氨基青霉烷 酸(6-APA)和7一氨基一3一脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA)，在制药领域应用广泛．此外，青霉素酰化酶也 被广泛用于手性化合物的酶法合成与拆分 J，IJi等 利用青霉素酰化酶合成了具有不同旋光性的 - 苯丙氨酸；Cabrera等 利用固定化青霉素酰化酶拆分了(±)一甲基苯丙二酸等．工业生产中通常使用 固定化的青霉素酰化酶．目前，已有多种方法被用于青霉素酰化酶的固定化，如 Zhou等 将青霉素酰 化酶固定在经不同亲疏水性离子液体修饰的磁性硅纳米球复合材料上，展现出较强的活性、较高的稳 定性和重复利用率；Chen等 将金属离子亲和色谱法与膜工艺有机结合，制得金属离子亲和膜，并将 青霉素酰化酶固定在此材料上，极大提高了酶在缓冲液中的储藏稳定性．与游离酶相比，固定化酶在 变化的外界条件下更稳定，可操作性更强。 交联酶聚体 (Cross．1inkedenzymeaggregates，CLEAs)lo]是一种新型无载体固定化酶技术，在溶液 中使酶蛋 白分子发生物理聚集，随后利用交联剂戊二醛对聚集体进行化学交联，从而稳定天然酶分 子．该方法制备过程简便，所得固定化酶稳定性强，易于回收和重复利用．由于 CLEAs全部 由酶蛋 白 组成，未引入载体，避免了载体材料对反应体系的污染，单位质量酶活高，制备成本低，展现出很好的 应用前景．Hormigo等 将制得的聚羟基丁酸酯(PHB)解聚酶 CLEAs用于PHB的水解反应，连续反 应20次，酶活无损失；Sinirlioglu等 ¨利用漆酶cLEAs进行工业孔雀石绿染料的脱色，发现CLEAs在 55℃仍具有70％的保留酶活，显示出比游离酶更高的稳定性，并且脱色活性提高近200％．高温可以 提高酶的催化效率，但同时也会造成酶的热失活．游离酶经过固定化后其热稳定性会有所提高 ．因 此，本文对青霉素酰化酶CLEAs的制备工艺和应用条件进行了系统考察，并在此基础上与游离酶对比 研究了其热稳定性，通过热失活动力学分析，解释了CLEAs具有优 良热稳定性的原因． 1 实验部分 1．1 试剂与仪器 青霉素酰化酶(浙江顺风海德尔有限公司)；BCA蛋白试剂盒(碧云天生物技术公司)；硫酸铵、对 收稿 日期 ：2013—10—15． 基金项 目：国家 自然科学基金(批准号21206113)和天津市应用基础研究计划项 目(批准号：13JCQNJC09300)资助 联系人简介：齐 崴，女，博士，教授，主要从事酶工程与生物催化研究．E-mail：qiwei@tju．edu．cn 王梦凡，女，博士，讲师，主要从事酶工程研究．E—mail：mwang@tju．edu．cn 慕洋洋梅等：青霉素酰化酶交联酶聚