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维普资讯 第 8卷第 4期 过 程 工 程 学 报 、 1．8No．4 2008年 8月 TheChineseJournalofProcessEngineering Aug．2008 cTnI特殊位点抗原的重复表达、免疫及其抗体效价检测 时丽丽 ， 李 强 ， 袁其朋 f1．北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029；2．清华大学化学工程与工艺系，北京 100084) 摘 要：构建了含人cTnI蛋白稳定区段 2个特殊抗原决定簇位点的pMAL—Antigen质粒．利用BamHUBgLII两限制性 内切酶的同尾酶作用进行连接，在pMAL-p2x质粒的MBP(麦芽糖结合蛋白)之后接入了上述 5个相同的片段．此质粒 在大肠杆菌E．coliBL21 E3)中经 1．0mmol／LIPTG诱导表达出的融合蛋白MBP—Antigen经Amlyose—resni亲和层析 柱纯化后免疫BABL／C小鼠，成功获得了能抗人cTnI和抗牛cTnI的抗血清． 关键词：人cTnI；特殊位点；麦芽糖结合蛋白；Amylose—resin亲和层析；抗体 中图分类号：Q81 文献标识码：A 文章编号：1009-606X(2008)04-0789—05 1 前 言 抗原免疫动物得到的多抗后续操作繁杂的过程． 心肌钙蛋白I(CardicTroponinI，cTnI)作为心肌蛋白 2 实验材料和方法 特有的组成成分 ，在急性心肌梗塞(AcuteMyocardial Infarction，AMI)的临床检测中己受到广泛的重视，近几 2．1菌株与质粒 年来cTnI己成为AMI临床诊断的金指标_】I2]，且患者血 E．coliBL21(DE3)，E．coliTOP10，E．coliJM109 液中 cTnI量与病情程度呈正相关性[3]．血液循环中的 (DE3)菌株为本实验室保存，pMAL—p2x质粒购于英国 cTnI以多种形式存在_4]，其N和c端易被降解，中间 NewEnglandBiolabs公司． 部分 28—110氨基酸残基是稳定存在区域[】 ．研究表 2．2培养基 明，cTnI抗体对不同存在形式的cTnI有不同的亲和力， 采用 LB标准培养基，诱导时为 LB标准培养基内 cTnI不同存在形式都会影响单抗与 cTnI的结合，从而 含 0．2％的葡萄糖． 影响检测的灵敏度 l引． 2．3酶与试剂 目前检测 cTnI的方法有多种，但最典型的是双抗 DNA 限制性 内切酶、T4DNALigase购 自日本 体夹心法．该方法能够成功的关键是获得 2个抗 cTnI Takara公司，高保真PCR采用pfu聚合酶，购 自北京赛 不同位点的抗体，并要求在进行双夹心检测时能够配对 百盛基 因技术 公司 ，质粒 小提试剂盒及 E．coli 使用．由于cTnI的特点，作为检测的抗体必须具备以下 Topl0／BL21(DE3)感受态细胞购 自北京天根生化科技技 条件：此抗体能与 cTnI稳定区域结合、能与任何形式 术公司，引物委托 日本 Takara公司及北京赛百盛基因技 的cTnI产生免疫反应、2种抗体能同时与 1个抗原发生 术公司合成 ，DNA测序 由北京三博远志生物技术有限 反应，即恰好配对抗体． 公司完成 其他化学试剂均为分析纯． 现在临床检测所用商品抗体多用人cTnIfhcTnI)全 2．4十二烷基磺酸钠一聚丙烯凝胶电泳 (SOS—PA6E)分析 蛋白作为抗原免疫动物获得多抗，然后再选取可用于检 将培养好的大肠杆菌悬浮液以10000r