时间分辨技术的原理.doc

时间分辨技术的原理 目前最先进的免疫检测技术： 时间分辨原理： 用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标记蛋白质、多胎、激素、抗体、核酸探针或生物流行性细胞，当反应体系发生后，用时间分辨仪器测定最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。 时间分辨原子标记物的特点： 发射光和激发光有较大的STOKES位移——高特异性 长寿命荧光，降低其他物质的荧光干扰——高灵敏度 半衰期长达几十万年，试剂受干扰小——高稳定性 原子标记与大分子标记物的对比 　 原 子 标 记 物 大 分 子 标 记 物 标记位点 多个,可达20个 只有1个 对被标记物蛋白活性的影响 影响小,基本无影响 影响大,经常影响蛋白活性 对被标记物空间结构的影响 无影响,保证稳定性 影响大,造成试剂的不稳定 受环境因素的影响 影响小 影响大,温度影响 3、波长分辨： 标记离子的荧光激发光波长范围较宽，发射光光谱范围较窄，是类线光谱，有利于降低本底荧光强度，提高分辨率。 激发与发射光之间有一个较大的STOKES位移，有利于排除非特异荧光的干扰，增强测量的特异性。 4、时间分辨： 标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境中荧光物质对检测结果的影响。 每一秒名检测样品1000次，取其中不受干扰的400次的均值作为测定值，有利于提高检测的准确性。 时间分辨技术取代酶免、放免是免疫检测技术发展的必然趋势！ RIA（放免） 放射性（125I），对环境和身体的危害，已经为重视环保的国家逐步取消，如整个欧洲仅尚存几个放免试验室。 125I半衰期短，导致试剂的有效期短，需每次定标，造成很大的浪费。 由于标记物（125I）的不断变化，带来药盒批间、批内较大的变异，标准曲线无法保存备用。 ELESA（酶免） 灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。 酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性、重复性不好。 与其它技术的相对优势： （1）、是现有的免疫检测方法中灵敏度最高的 （2）、是现有的免疫检测方法中稳定性最好的 （3）、多标记检测是目前所有免疫检测技术中独一无二的 TRF技术与电化学发光的比较 　 时间分辨荧光 电化学发光 标记物 四种原子:Eu,Sm,Te,Dy 一种原子:钌 多标记技术 有 无 科研项目 能(1000多种科研项目) 无 试剂种类 58种临床,24种科研,共82种 40种临床,无科研 试剂价格 低 高 TRF与化学发光的比较 　 时间分辨荧光 化学发光 发光效率 95% 1% 重复检测 可无数次重复 不可重复 本底噪声 零本底 干扰大 灵敏级数 10-19 10-15　 标记物 原子 大分子化合物 标记位点 每个抗体可达20个 1个 标准曲线 稳定达一年以上 稳定2到4周 多标记 有,最多可达四标记 无 科研开发 有 无 时间分辨荧光免疫定量分析简介 时间分辨荧光分析（Timeresolved Fluoroimmunoassay,TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。 解离增强镧元素荧光免疫分析是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕（Eu）连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体/抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，因此加入一种增强剂，使Eu3+从复合物上解离下来，自由Eu3+同增强剂中的另一种螯合剂螯形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。 乙肝病毒（HBV）标记物的检测方法常用测定乙肝病毒的抗原、抗体标记物，由60年代末70年代初的琼脂扩撒法，依次发展为血凝法→酶联免疫吸附（ELISA）、同位素免疫标记（RIA）→化学发光免疫分析、生物发光、电化学发光免疫标记和80年代中建立的稀土离子荧光标记（时间分辨荧光免疫分析）等不同的检测方法。随着科学的发展和检验技术的进步，其方法每发展一步，乙肝标记物检出的灵敏度和准确性都得到不同的提高。 时间分辨荧光免疫分析（TRF）为近年新研制成功的用三价稀土离子作为示踪物，以单克隆抗体包被支持物与样品中抗原反应，再加入有铕（EU）标记的抗体，进行反应检测，可大大降低一般同位素和荧光标记