降钙素基因相关肽基因导入糖尿病大鼠阴茎海绵体及其对勃起功能的作用.pdfVIP

摘 要 降钙素基因相关肽基因导入糖尿病大鼠 阴茎海绵体及其对勃起功能的作用 专 业 外科学(泌尿外科学) 博士研究生 周卸来 导 师 沈周俊教授 第一部分 降钙素基因相关肽真核表达载体peDNA3．1／CGRP的构建 目 的 构建带有大鼠降钙素基因相关肽基因(圮Gl冲)的重组真核表达载体 pcDNA3．1(+)们GRP，用于基因治疗糖尿病性勃起功能障碍的实验研究。 方法 根据Genbank中疋GRP基因序列设计一对DNA引物，在引物上加上双酶 GelEx溉tion 通过HindⅢ和BamH Kit纯化、16℃过夜连接， I酶切、QIAqmck CoilDH5 将目的基因插入真核表达质粒载体pcDNA3．1(+)，转化Ea感受态 细菌，通过氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆，再经PCR、酶切和测序鉴定所得克 Pl勰midMidi Kit大量 隆，确证pcDNA3．1(+)幻CORP构建成功后再用QIAGEN 扩增、纯化质粒备用。 结果 凝胶电泳可见28S和18S两条清晰条带； (2)RT-PCR卢勿鬯苏分衍扩增产物行l％琼脂糖凝胶电泳后可见一条特异的片 段，和rCGRPcDNA大小相吻合。 偿，重绥右蘑笙定①PCP,鉴定PCR产物行1％琼脂糖凝胶电泳后可见～条特异 的片段，和rCGRPcDNA大小相吻合；②酶切鉴定抽提质粒经双酶切，酶切产 物行1％琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像仪下可见两特异性条带，分别和 分析，与rCGRP基因编码区全长序列完全一致。 结论 (1)大鼠脑组织中有rCGRP的表达； 关键词 降钙素基因相关肽；pcDNA3．1；DNA重组 第二部分 糖尿病大鼠模型的建立及勃起功能测定 目 的 建立勃起功能显著低于正常水平的糖尿病①M)大鼠模型，为进一步行糖尿 病性勃起功能障碍(DMED)的CGRP转基因治疗提供理想的动物模型。 方法 2 验组心=138)。实验组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)溶液60 mg／kg，对照组腹 腔注射相应剂量的O．IM pH4．5枸椽酸钠溶液。注射后3d，于尾静脉采血测血 糖，后每2wk测血糖1次。实验期间按照DM判断标准判断每只大鼠DM模 型成功与否。STZ注射后10wk，从DM模型制作成功的大鼠中随机选取12只， 刺激诱导ICP，并和正常对照组比较。 结果 血糖未达糖尿病标准，糖尿病表现不明显，判为STZ抵抗。138只大鼠中DM 模型制作成功131只定为DM组，成功率94．9％。 纪伍劳．触重DM组STZ注射后各时间点的血糖水平均显著高于对照组 后10wk DM组的体重显著低于对照组∞0．001)，平均体重较对照组低30．4％。 士0．27和0．064士O．022