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几种食源性致病菌快速检测技术的建立 摘 要 近年来，由于食品安全事件频发，食品安全问题越来越成为社会关注的热点。 其中，食源性致病菌是引起食品安全问题的重要因素。金黄色葡萄球菌、沙门氏 菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、单核细胞增生李斯特茵、蜡样芽胞杆菌和溶藻弧菌 是常见的食源性致病菌。目前检测食源性致病菌手段主要采用细菌分离、培养、 生化鉴定等方法，操作繁琐，检测周期长，每次只能检出一种细菌，一般需要 5～7天才能给出检测报告，且敏感度低、特异性差。因此研究食源性致病菌快速、 准确检测方法以预防和控制食品安全事件的发生，具有重要的现实意义。 近年来，随着食源性致病菌的全基因序列的测定与分析，以及大量毒株部分 基因序列的获得，越来越多的分子生物学技术以其快速、灵敏等优势得到了广泛 的应用。本文根据以上提到的几种常见的食源性致病菌的保守毒力基因序列，分 别建立了副溶血弧菌tdh基因的LAMP检测方法，五种食源性致病菌多重PCR 检测方法，七种食源性致病菌基因芯片检测方法，为食源性疾病的快速诊断和预 警监测体系的建立提供了重要的技术保障。 环等温核酸扩增技术是一种在等温条件下高特异性、高效、快速地扩增靶基 因的DNA扩增技术。应用在线软件Primer ExplorerV4．0，针对副溶血弧菌特异 性的毒力基因tdh基因设计LAMP引物。对反应温度和反应时间等参数进行了 优化，同时将建立的LAMP检测方法与PCR方法进行了比较分析。结果表明， LAMP检测最适反应在60．8℃恒温条件45min内完成，凝胶电泳呈现梯形条带， 与其他常见的细菌无交叉反应。LAMP检测方法的细菌DNA最低检出限为35．5 h内完成检测，操作简 彰反应管，灵敏度较PCR高10倍，而且LAMP方法在1 单，不需复杂仪器，用建立的LAMP方法对扇贝样品中分离菌株进行了检测表 明，LAMP方法对检测致病性副溶血弧菌具有很好的可靠性。 多重PCR是在一个反应体系中加入了多对引物，在同一体系中对多个目的 片段同时扩增。该方法克服了常规PCR及LAMP检测一次只能扩增一个目的片 段的缺点。本文探索了一种同时特异性地检测五种常见食源性致病菌的多重PCR 方法。根据目前食品中常见病原菌副溶血弧茵Vibrio 葡萄球菌Staphylococcus enteritidi、福氏志贺氏菌跚咖砌 monocytogenes、肠炎沙门氏菌Salmonella Flexneri的相关毒力基因，选择具有特异性的副溶血弧菌不耐热溶血毒索基因 (thennolabile stable hemolysingene，tlh)、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因(heat nuelease gene，nuc)、单核细胞增生性李斯特菌的编码溶血素。基因hlyA、肠炎沙 A 门氏菌的侵袭蛋白A基因(invasion proteingene，invA)及志贺氏菌侵袭性质粒抗 原H基因(invasion H plasmid antigengene，驴胡)，分别设计一对特异性引物进行 多重PCR检测，对反应条件进行优化并评价了其特异性和灵敏度。通过对扇贝 样品检测验证了此多重PCR体系具有很好的可靠性和实用性。 本文建立了基于多重PCR结合基因芯片技术同时检测副溶血弧菌、金黄色 葡萄球菌、单核细胞增生性李斯特菌、沙门氏菌、志贺氏菌、蜡样芽胞杆菌和溶 藻弧菌的方法。选择副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因、金黄色葡萄球菌的耐热核 酸酶基因、单核细胞增生性李斯特菌编码溶血素O基因、沙门氏菌侵袭蛋白A 基因及志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因进行五重PCR扩增，选择蜡样芽胞杆菌 cnt锄toxin 非溶血毒素基因(non-haemolytic