苜蓿夜蛾和大豆心虫气味感受相关蛋白基因的克隆分析及表达.pdf

摘要 摘 要 苜蓿夜蛾(鳞翅目：夜蛾科)和火豆食心虫(鳞翅目：小卷蛾科)是大豆生长期和结荚 期的两种主要害虫，随着近年来兔耕和重迎茬面积增加，两种害虫的发生明显加重，成为造 成大豆品质和产量降低的主要因素之一。昆虫触角是嗅觉感器分布集中的部位，触角上的各 种感器调节着昆虫行为与化学、物理等各种环境刺激因子的关系，在昆虫的寄主定位、识别、 取食、觅偶、交配、繁殖、栖息、防御与迁移等过程中起着极为重要的作用。因此，研究其 嗅觉感器的形态与结构是探索昆虫嗅觉行为和识别机制的必要前提。昆虫的嗅觉识别过程是 非常复杂的，多种蛋白参与了这一过程，这些蛋白主要包括气味结合蛋白、气味受体以及气 味降解酶。深入研究嗅觉识别过程中的儿个主要蛋白的结构与功能对于阐明嗅觉识别的分子 机理非常重要。因此，本试验以苜蓿夜蛾和大豆食心虫为研究对象，利用扫描电镜对触角的 超微结构进行了观察，利用RT-PCR和RACE的方法克隆得到了嗅觉识别的相关基因，并对 相关基因的功能进行了分析，以期为阐明这两种害虫嗅觉识别的分子机理提供依据。 利用扫描电镜对苜蓿夜蛾触角上的感受器类型进行观察，结果表明，雌雄苜蓿夜蛾的触 角类型都是线状触角，由柄节、梗节和鞭：常组成。触角上有8种感器分布，分别为毛形感器、 刺形感器、锥形感器、腔锥形感器、耳形感器、鳞形感器、栓锥形感器和B6hm氏鬃毛，触 角感器主要分布于触角的迎风面和侧面，柄节周围被鳞片包被，鞭节背风面有半包围状整齐 排列的鳞片，鳞片结合处有零星分布的磷形感器、刺形感器；在整个触角上，感器主要集中 在鞭节，柄节和梗节较少。不同类型感器相比而言，以毛形感器数量最多，刺形感器排列较 为整齐和规律。每一鞭小节背风面都覆盖有鳞片，后排鳞片的前缘盖着前排鳞片的基部，层 层相叠，绝大多数感器着生在触角的迎风面和侧面。 利用RT-PCR和RACE的方法得到了苜蓿夜蛾和大豆食心虫的五个气味结合蛋白(OBP) 和一个气味受体蛋白(Or83b)基因的全长，其中包括两种昆虫的信息素结合蛋白(PBP)和 蛋白。用苜蓿夜蛾的信息素结合蛋白、普通气昧结合蛋白l和2三条序列构建了三个基因的 原核表达载体，并且在大肠杆菌中成功进行了表达。 苜蓿夜蛾PBP基因cDNA序列的全长为625个碱基，包括一个510个碱基的开放读码框， 编码170个氨基酸组成的多肽，推导出的分子量为19．0kD，预测等电点pI为5．65。在27．28 位为信号肽切割位点，并存在1个N位糖基化位点。大豆食心虫PBP基因cDNA序列的全 长为610个碱基，包括一个504个碱基的开放读码框，编码168个氨基酸组成的多肽，推导 出的分子量为19．3kD，预测等电点pI为5．55。在24．25位为信号肽切割位点，并在52的位 置上有一个N位糖基化位点。通过和已知昆虫PBP基因eDNA序列的对比，发现两种昆虫 的PBP基因氨基酸序列有典型OBP家族特点的六个保守的半胱氨酸，苜蓿夜蛾和大豆食心 虫PBP与其他已知鳞翅目昆虫PBP的同源性分别在44％．96％和45％．70％之间，对比过程中 发现在已研究昆虫PBPs的研究发现多种昆虫中存在三种PBPs，也就是PBP存在不同的亚型， 多种PBP存在的特征可能与昆虫间信息素成分的多样性有关。 东北农业大学农学博士学位论文 !!!曼皇曼曼!!曼量曼曼曼暑!皇曼詈曼曼鼍皇鲁詈鼍!!詈皇墨詈!曼鼍量曼曼詈詈鼍皇曼曼曼皇詈墨曼曼!!!皇墨!曼曼皇鼍曼曼曼曼曼皇詈曼!!皇皇曼暑曼!曼曼皇鼍!!!!!!曼詈曼!!苎 码框，编码164个氨基酸组成的多肽，推导出的分子量为19．0kD，预测等电点pI为5．32。 在19—20位为信号肽切割位点。大豆食心虫GOBPl基因eDNA序列的全长为920个碱基， 包括一个492个碱基的开放读码框编码163个氨基酸组成的多肽，推导出的分子量为18．8kD， 序列对比，发现两种昆虫的GOBPl基因氨基酸序列有典型OBP家族特点的六个保守的半胱 氨酸，苜蓿夜蛾和大豆食心虫GOBPl与其他已知鳞翅目昆虫GOBPI的同源性分别在 63％．95％和65％．82％之间。 框，编码162个氨基酸组成的多肽，推导出的分子量为18．2kD，预测等电点DI为5．30。在 21．22位为信号肽切割位点。通过和已知昆虫GOBP2基因的eDNA序列对比，发现有典型 OBP家族特点的六个保守的半胱氨酸，与已知鳞翅目昆虫GOBP2的同源性在75％-99％，说 明GOBP2基因在鳞翅