茶树体内茶氨酸成酶的克隆与异源表达及一氧化氮信号对其调控的研究.pdf

安徽农业大学博士论文 中文摘要 摘 要 茶是目前世界上饮用量最大的非酒精类饮料，L-茶氨酸是茶树体内特征性非 蛋白质氨基酸，不仅决定了茶的风味还有非常广泛的药理作用。茶氨酸合成酶 （Theanine synthetase，TS ）不仅是茶氨酸合成的关键酶，也对茶树体内的氮代 谢有重大影响。研究表明，茶氨酸合成酶基因序列与谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase, GS ）基因序列有高度同源性，有可能是谷氨酰胺合成酶基因家族成员， 对其进行研究，不仅有利于掌握茶氨酸代谢与调控的规律，也有助于了解茶树体 内氮同化与转运的机理。本研究利用RT-PCR 的方法克隆了茶树体内茶氨酸合成 酶基因（DD410895 ）与谷氨酰胺合成酶基因（AB115184 ），通过原核与真核表 达进行功能验证，并将原核表达的蛋白纯化以制备多抗；在此基础上，利用生物 信息学的手段对TS与GS推导出的蛋白质序列进行结构与功能的分析，并利用系 统进化树的方法对它们在GS基因家族中的地位进行聚类分析；利用HPLC检测与 Western Blotting相结合的方法对不同NO诱导处理下茶籽苗中TS 的表达与茶氨酸 的积累进行分析。通过上述研究得到以下结果： 通过提取茶树根部与叶部总RNA ，进行RT-PCR ，克隆得到茶树茶氨酸合成 酶基因（DD410895 ）与谷氨酰胺合成酶基因（AB115184 ）。获得的TS基因长度 为1071bp，与已知的茶树TS基因的氨基酸序列有3个氨基酸的差异，与其他植物 GS基因具有较高的同源性，获得的GS基因与已知的茶树GS基因的氨基酸序列有 1个氨基酸的差异。对两条基因进行原核表达后得到可溶性蛋白，进行酶活力验 证，结果表明，表达的TS蛋白能够催化谷氨酰胺与盐酸乙胺合成茶氨酸，而不 能催化谷氨酸与盐酸乙胺合成茶氨酸，也不具备GS 的催化活力，酶促反应产生 的产物用HPLC与ESI-MS进行鉴定，确定为茶氨酸；而表达的GS蛋白明显具有 转氨基的催化活力，相较于细菌本身GS催化能力大大增强。 构建植物双元表达载体pGREEN-35S-TS/GS ，导入农杆菌，运用花序侵染法 转入拟南芥，分别获得转茶TS和GS基因的转基因拟南芥，通过除草剂Basta对后 代进行筛选，并利用PCR 的方法对阳性植株进行鉴定。利用载体上的GFP标签对 转TS基因的拟南芥根尖细胞进行激光共聚焦显微镜观察，发现融合蛋白主要存 在于细胞质中。 用Expasy软件包和CBS，Swiss-Model，InterProScan等网站的在线分析工具 I 安徽农业大学博士论文 中文摘要 对TS与GS 的理化特性，蛋白结构等进行分析与预测。结果表明TS 的理论等电点 PI=5.52 ，蛋白质相对分子质量MW=39306.3Da ，GS 的理论等电点PI=6.13 ，蛋白 质相对分子质量MW= 39240.3Da ，二者均为易溶、亲水性强的蛋白，不存在跨膜 结构。二级结构预测表明二者都是混合型蛋白结构差异不大。氨基酸序列和结构 分析显示TS与GS蛋白均包含了一个GS beta-Grasp 结构域和一个GS 催化结构 域，这些功能区在植物的谷氨酰胺合成酶中是保守的，均为Gln-synt结构域。运 用软件对蛋白的细胞定位和功能分析表明，TS与GS蛋白主要定位于细胞质内， 具有转录、转录调控和信号转导功能的概率较高。运用同源建模软件 SWISS-PdbView对TS三维结构进行预测，并以玉米GS蛋白三维结构为模板（编 号:2d3a）用metapocket软件对TS蛋白活性中心进行分析，预测出三个酶反应的结 合位点，其位置与GS大致相当，但是其所能结合的氨基酸位点有着细微的差别， 可能就是二者催化反应差异的原因所在。运用Mega4.1软件构建了GS 的系统进化 树，表明TS属于GS家族成员，并且可以将山茶属GS蛋白划分为3类。 利用外源一氧化氮（NO ）供体硝普钠（SNP ）提供不同浓度的NO处理幼嫩 茶籽苗，发现能够明显促进TS 的表达和茶氨酸的积累，短期内NO浓度的提高能 明显增强茶籽苗体