绿色荧光蛋白基（gfp）转化柑橘及植株再生.pdfVIP

绿色荧光蛋白基因(gfp)转化柑橘及植株再生 摘要 柑橘是世界第一大水果。通过遗传改良方法创造优质、多抗及不同成熟期的品 种类型，是我国柑橘育种研究的重点。然而柑橘属植物存在珠心胚干扰、童期长、 雄雌性败育等现象，传统育种手段效率不高、进程缓慢。近年来，不断完善的转基 因技术为我们提供了一种更加快速直接的育种和品种改良手段。 本实验以柑橘愈伤组织和试管播种实生苗上胚轴为外植体，用根癌农杆菌介导 法进行绿色荧光蛋白基因(gfp)的转化，获得14个品种的转基因材料，同时对转 化程序、转化机制和外源基因表达进行了探讨与分析。一些带有GFP标记的材料已 用于本课题组的细胞融合和细胞凋亡等研究。众多的转基因柑橘细胞系还为后期的 遗传转化相关机制研究提供了试材和便利。主要结果如下： 1)在得到的14个品种的转基因材料中，2个品种获得了再生植株，1个品种得到了 试管苗，5个品种处于胚状体阶段，6个品种尚在愈伤组织阶段。 2)共得到来自不同转化事件的细胞系／株系93个，将进行Southern Blot分析，研究 外源基因在柑橘中的整合规律(整合位点、拷贝数)。 3)温州蜜柑品种国庆一号(GI)的转GFP基因愈伤组织荧光表达强烈且稳定，已 成为本课题组细胞融合和细胞凋亡研究的一个活体工具材料。 4)比较了抗生素筛选与GFP荧光筛选的精确性及其对转化进程的影响，证实GFP 筛选比抗生素筛选更快速、简便、可靠，GFP标记的应用大大缩短了转化所需的 工作量和时间。 5)x,l决定柑橘愈伤组织转化效率的几个因素进行了比较与分析，表明： ①转化效率的前期决定因素是农杆菌与愈伤组织细胞的互作，以下操作可使 这种互作有利于转化效率达到较高水平：由继代历史不超过2年的农杆菌菌株 新长出的菌液侵染生长旺盛、颗粒状明显的淡黄色愈伤组织悬浮细胞，先摇动 侵染体系使二者充分接触．然后静置20rain使农杆菌稳定附着在植物细胞壁 上；在侵染后共培养前使愈伤组织细胞造成损伤或在共培养基中加入创伤诱导 因子(如AS)均有利于农杆菌Vir基因的活化和T-DNA转移。 ②转化细胞的存活和再生是转化成功的前提。采用继代历史不超过3年的胚 性愈伤组织以保证其较为健全的胚胎发生能力。为防止农杆菌过度增殖对再生 的毒害效应，应注意侵染浓度不宣过高、侵染时间和共培养时间不宣过长，在 共培养后使用头孢霉素防止农杆菌残留存活。共培养后最好能给愈伤组织1—2 周的延迟筛选以使细胞恢复活力。在筛选培养对，要使每一块愈伤组织能充分 与培养基接触以保证营养供给并接受抗生素的筛选：要及时将转化愈伤组织团 挑出单独在不加筛选抗生素的培养基上培养并诱导再生，避免抗生素对再生的 不良影响，缩短筛选过程。 6)利用GFP荧光监测了柑橘上胚轴切段的转化与再生过程，发现： ①共培养后2—4周的暗培养使伤口表面形成愈伤组织，由这些愈伤组织可以 分化出较多的小芽：若共培养后直接置于光下培养，切口发生硬化而难以出 芽。 ②转化芽点大多出现在伤口的形成层环部位。 ③逃逸体的存活有赖周围转化小芽的保护或因农杆菌残留而表现卡那霉素抗 性，可见抗生素筛选的精确性不高。 7)对转化子再生过程中的荧光表达进行了连续观察，发现愈伤组织、黄化组织(根、 茎尖)以及幼嫩小芽的荧光最为明亮{在转化子交绿和继代次数增多后，GFP 荧光由于叶绿素自发红色荧光的干扰而变得不明显。 8)通过荧光检测发现了一些转基因嵌合体，分析由上胚轴得到的扇形嵌合体的成 因，如果其转化的部分来源于形成层环再生的愈伤组织细胞，另一部分来源于上 胚轴的维管组织，这可能是“能够感受农杆菌转化的细胞位于由伤口形成层环长 出的愈伤组织中”的又一个试验证据。 9)选取增殖快速的转化材料(GI、SBT橘橘柚的愈伤组织和杂种GWZ的胚状体连 同小芽)进行了PCR和Southernblot分析，结果表明GFP荧光鉴定与PCR检测 在证实GFP基因存在上有高度的一致性：Southernblot分析正在进行之中。 关键词：柑橘绿色荧光蛋白根癌农杆菌遗传转化 FluorescentPro