茶树被茶尺蠖取诱导的一个13-脂氧合酶基因的分离、功能鉴定与表达分析.pdfVIP

摘 要 茉莉酸 （JA）是植物对害虫取食诱导而产生直接防御的重要信号物质，而脂氧合 酶（LOX）是 JA 合成的关键酶之一，因此有关植物 LOX 研究备受关注，然而茶树 体内 LOX 的相关研究甚少。本论文以课题组前期获得一条被茶尺蠖取食诱导表达， 且可能为 LOX 基因的 EST （GenBank：GW342753）为基础，通过cDNA全长克隆、 原核表达、高效液相色谱、荧光定量 PCR对茶树 LOX 的酶学特征和基因表达特征进 行研究。主要结果如下： （1）通过 cDNA末端快速克隆(RACE)方法获得一条编码茶树 LOX 的全长cDN  A  序列，其开放阅读框长度为  2706  bp，编码  901  个氨基酸，并命名为  CsLOX3  （GenBank：HM440161），且其理论分子量和等电点分别为 101.84 kD 与 6.39；同源 比对分析结果发现 CsLOX3 与已经报道的茶树的 CsLOX2 同源性最高，为 80%；生 物信息学分析发现 CsLOX3含有叶绿体转运肽，可能位于叶绿体，其保守功能区域有  3+  3个， 且与 Fe  结合的活性位点有 5个氨基酸， 分别是 His ，His ，His ，Asn ，  554 559 751 755 Ile 。 901 （2）原核表达分析表明，重组后 CsLOX3 主要分布于此基因转化的大肠杆菌裂 2+  解物上清中，SDS­PAGE显示其分子量为 120 kD 左右。利用 Co  ­TALON Resin 树 脂进行蛋白质纯化，并对其进行相关酶学活性分析表明，CsLOX3发挥酶活的最适温 ­1  ­1  度为 45 °C，此温度下酶活力为(24.6 mmol∙min  ∙mg  )  最适 pH5.0，此 pH 下酶活力为  ­1  ­1  (22.57 mmol∙min  ∙mg  )；通过 HPLC分析发现，原核表达的 CsLOX3 酶促反应只生成  13­HPOT，因此属于 13S­LOX类型。 （3）qRT­PCR 分析表明，C sLOX3基因在茶树果实形成和开花初期表达量较低， 而在成熟期和盛花期表达量皆上升到最大，分别为初期的 16 倍与 15.3 倍；CsLOX3  基因在茶尺蠖取食后 6­24 h 一直处于上调表达状态，但是不同品种表达规律不尽相 同，上调表达的开始时间和最大表达量出现时间都是舒茶早品种较龙井 43 晚，但是 最大表达量相差不大，分别比对照高出 10倍与 13.6倍；机械损伤对其表达规律影响 与茶尺蠖取食相近，只是品种间差异较大，表现为舒茶早的 CsLOX3基因最大表达量 要明显大于龙井 43，分别是各自对照的 10.6 倍与 3.6倍；MeJA 处理龙井 43 后 2d，  CsLOX3 基因表达量急剧升高至对照的 17.3倍，至 4 d后又急剧下降，而对舒茶早影 响不大，最大表达量仅是对照的2.1倍。 关键词： 茶树，茶尺蠖，脂氧合酶，基因克隆，功能鉴定 I  Abstract  The jasmonic acid （JA）is important signal molecule fed by insects, lipoxygenase is  the first key enzyme synthesised JA, so this enzyme is concerned for a long time, but the  research of lipoxygenase is little in tea plant(Camellia Sinensis). This paper got a EST of  LOX （GenBank：GW342753）, so we plan to use RACE, prokaryotic ex