重组DNA技术与基因工程..ppt

PCR克隆目的基因的基本程序 基于同源重组的In-Fusion克隆法 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 与载体5’端15个碱基相同的序列 目的基因序列 PCR扩增 In-Fusion酶介导同源重组 盒式PCR扩增法 适用于外侧序列未知的靶基因扩增 染色体DNA Sau3A部分酶切 连接，加装盒式接头片段 5 ’ 端不含磷酸基团 变性 引物退火 P1 P2 P1 退火 延伸 5 ’ 5 ’ 5 ’ 基因内引物扩增 5 ’ 5 ’ 5 ’ P2 5 ’ 5 ’ 5 ’ P1、P2为盒式引物 5 ’ 5 ’ 测序设计保守引物 基因组DNA切割并自连成环 反向PCR扩增法 TAGTSLVVRK NYWSSAEPHC 蛋白质 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 根据已知的氨基酸序列设计简并引物 简并引物介导RT-PCR 保守引物介导PCR 测序确定目标基因的两端序列 D 化学合成法 化学合成法的基本战略 化学合成的单元操作 DNA化学合成的用途 4 目的基因的克隆与基因文库的构建 化学合成法的基本战略 全基因合成 化学合成目的基因的前提条件是基因的DNA序列已知，有三种战略： 小片段粘接法： 混合退火 根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段。 T4-DNA连接酶连接 克隆入合适的载体 补钉延长法： 混合退