重组克隆的筛选与鉴定..ppt

第七章 重组克隆的筛选和鉴定 内容提要 第一节 载体表型选择法 第二节 DNA电泳检测法 第三节 核酸杂交检测法 第四节 免疫化学检测法 第五节 转译筛选法 第六节 真核重组基因的选择方法 一般克隆与筛选策略 第一节 载体表型选择法 根据载体提供的表型进行选择的方法： 抗生素抗性基因的插入失活选择法 ?-半乳糖苷酶的显色反应选择法 一、插入失活法的原理 一般原理 一种利用抗生素抗性基因或其他基因的插入失活，来筛选重组子的方法。 通常外源DNA插入的位点设计在特定基因上，一旦外源DNA插入，该基因就被破坏而失去活性。由此来判断载体上是否带有外源DNA。 二、利用抗生素抗性基因：pBR322 以pBR322为例，说明利用抗生素抗性基因的插入失活的原理。 1. 原理 在pBR322上有多个单一的限制酶位点，如BamH I位点，恰好在一个四环素抗性基因内。如果有外源DNA插入BamH I位点，那么涉及四环素抗性的基因就损坏，因此，带有重组pBR322质粒的细胞，仍对氨苄青霉素有抗性，但对四环素的抗性消失（敏感）。 2. 筛选的方法 ①转化细胞涂布于含有氨苄青霉素的固体培养基上，并培养至菌落出现。 ②用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体培养基表面接触一下。 ③适温培养，有的克隆生长，有的不生长。 ④根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培养