重组质粒构建..ppt

　 　 　 外源基因与载体的连接 粘性末端连接 * 由于操作简便，质粒最为常用。 * 严紧型：这些质粒的复制是在寄主细胞严格控制之下的，与寄主细胞的复制偶联同步。所以，往往在一个细胞中只有一份或几份拷贝； 松驰型：这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝， 不相容质粒携带复制子基本相似，复制系统也相同，在复制和分配到子细胞的过程中相互竞争。 TA克隆：TA克隆系统由Invitrogen公司（San Diego，CA）发展而来的商业性试剂盒，它用PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3’T突出端的载体，在连接酶作用下，可以快速地、一步到位地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。TA克隆没有方向性。? * 消耗能量 长转录导致不正确的二级结构，降低翻译效率。 * 丝状噬菌体F1 * * * * 总的来说连接反应时的温度不宜过高，否则片段末端容易松脱不易连接（分子热运动随温度升高而加剧），但又不能太低否则连接酶活性太低。 * * 有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……CCGG……3’，如果其中有5’-甲基胞嘧啶，