苹果砧木遗传转体系优化与rolb基因遗传转化研究.pdfVIP

羔型堂型堑望墅兰焦堕主 主墨壁查苎查垄塑苎鲞堡墨竺垡垡量!!!!苎里堕垫垡茎些要塞 摘 要 由于矮化密植具有旱果、丰产等优点，已成为国内外果树，特别是苹果生产的发展 趋势。目前，在苹果生产中，树体矮化主要是通过选育矮密品种和采用矮化砧木来达到 致矮目的，其中矮化砧是最理想的办法。苹果半矮化中间砧GM256具有矮化、抗寒、抗 旱、抗盐碱等优良特征，由于生根困难，只能用于做矮化中间砧，丢掉了抗旱、抗盐碱 等优良性状。转基因技术为苹果矮化砧的遗传改良开辟了一条新途径。利用转基因技术 插易生根，适于矮化密植的砧木新品种。 由于苹果离体再生困难，极大限制了苹果的转基因改良。本试验从苹果矮化砧木品 种M9和GM256组织培养体系的研究着手，优化苹果矮化砧的遗传转化体系，力争建立 GM2 56和M9的遗传转化体系。主要取得以下研究结果： 1．稳定、高效的腋芽增殖体系研究 由建立无菌体系开始，对影响初代培养的因素进行了优化。结果表明，在新梢还未 抽生前，最佳的接芽状态是待侧芽已露出4～5片小叶时接种；新梢快速生长期(4-5月) 是最佳的取材时期；采用综合防治的方法即在初代培养基中附加o．1％的活性炭，同时结 合连续转移外植体，黑暗培养，有效防止了木本植物组织培养当中普遍存在的褐化现象。 培养基中可形成带有明显茎节的植株。以M9带单芽或双芽的茎段为外植体，通过正交 试验筛选出适宜的腋芽分化培养基FH8(MS+BA5．0mg／L+NAA0．02mg／Lo将带腋芽茎段 先在分化培养基中培养7天，然后将其转入无激素培养基中促进芽的生长，腋芽分化率 可达到98％，增殖倍数为5．1。较大的芽被切离母体单独培养，将茎段剩余部分作继代 培养，继代3次后仍有芽不断分化，增殖倍数又可提高，是一种较优的增殖途径。 2．不同因素对苹果离体叶片再生的影响 (1)激素对再生的影响：细胞分裂素是影响叶片再生频率的重要因子。通过设计 细胞分裂素和生长素组成不同的激素组合，研究了激素对叶片组织再生的影响。使用细 胞分裂素BA与生长素NAA组合时，叶片可膨大，随BA浓度提高，叶片产生愈伤组织的 量增加；使用肼与NAA组合时，叶片只是膨大，变脆，无愈伤组织的生成。而将M9叶 得16．7％的再生频率。细胞分裂素TDZ对诱导苹果离体叶片再生最有效。M9叶片在适宜 片未再生，这也许与它的基因型有关。在此培养基中再生出的不定芽不易伸长生长，且 T ． 童签垄些查兰堡±兰笪算塞 苹果砧木品种组织培养体系的优化与rolB基因的遗传转化研究 叶片形态发生改变，但将不定芽切分后转移到含有BA的培养基中，不定芽可恢复正常。 (2)糖对叶片再生的影响：糖在组织培养中既是碳素来源和能量物质，又是重要 的渗透压调节剂，对于离体组织的形态发生有着特殊作用。山梨醇和蔗糖适宜的浓度都 是309／L。在309／L的浓度下，两种糖对叶片再生频率的影响无差异，但叶片在附加山 梨醇的培养基中存活时间长，平均每叶再生的芽数多，但再生的不定芽矮小，生长缓慢。 可见，山梨醇对不定芽的分化有利，而蔗糖对不定芽的生长有利。 (3)其他因素对叶片再生的影响：研究叶片放置于培养基中的方向对叶片再生的 影响时，认为正放与反放对再生频率的影响不大，不定芽多产生于叶片中脉切口处与叶 柄基部，叶片正放对不定芽的生长有利；叶片切割方式以鏊叶划痕即垂直主叶脉横划三 刀，但不切断叶缘的方式获得最好的再生效果；叶片被切割成叶块，产生过多的愈伤组 织，再生频率降低；以丛生芽叶片再生出的不定芽的叶片为外植体，获得的再生频率高 于丛生芽叶片。 3．RoIB基因的转化 (1)抗生素的敏感度实验：通过试验发现，苹果叶片对卡那霉素特别敏感，5mg／L 足以抑制叶片再生；培养基中附加卡那霉素40mg／L时，就可抑制高度为2—3厘米的组 培苗生长，使整株植株黄化，茎尖萎蔫。 (2将高度在2～3cm的无根植株预培养在含生长素的培养基(1／2 养基表面，将涂抹了菌液的植株插在刚刚滴加茵液的位置共培养3天，之后转入脱茵选 培养基中继续培养，植株生根率达到20％。而未经过预培养的植株生根率为5％。将所获 得的5株生根苗的根尖剪下提取DNA，PCR检测证明有2株根中转入了rolB基因。