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苹果等果树种质资源的离体保存研究 缩略词表 华中农业大学(10504)2003届博士论文 苹果等果树种质资源的离体保存研究 摘要 植物遗传资源是人类赖以生存和发展的最重要的物质基础，保持其遗传多样性 是人类实现可持续发展的重要保证。果树是重要的经济作物，在国民经济中占有重 要的地位。传统的果树种质资源保存方法是田间种植保存，该方法易受病虫害、自 然灾害以及经费短缺等问题的困扰，使得大量的资源面临或已经流失。离体保存安 全可靠、占用空间小、节省开支，正在成为田间保存的重要补充技术。本研究在前 人工作的基础上，对苹果等重要果树资源的离体保存技术进行了较深入的研究，主 要结果如下： l建立了包括西洋梨(Pyr“scommunis)、沙梨(P pyrifoIia)、白梨(P 培养物，及适宜上述材料的通用继代培养基即MT+BAl．0 nl叽+ mgfL+NAA0．1 GA32．0 mg／L。为梨的离体保存研究初步奠定了基础。借鉴植物微茎尖及热处理脱毒 原理，通过暗培养促进枝条的伸长生长及弱化输导组织的发育，然后再培养茎尖， 成功地脱除了梨的内生菌，为组培材料内生菌的脱除提供了一个新思路。 2通过叶片再生胚状体途径，建立了富士、王林、嘎拉、八楞海棠、珠美海棠 和MMl06等6个苹果基因型的单胚系，为遗传变异研究提供了材料。 3确立了在继代培养基中添加低浓度秋水仙素长时间处理石榴茎段离体加倍 的有效方法，并首次获得了石榴的四倍体植株。四倍体植株田间表现叶色深绿、花 变大、育性下降等多倍体特征。该技术为石榴的育种开辟了一条新途径。 4通过对试管苗状态的调整，外植体类型及大小的选择，结合密闭减少氧气供 应和水分蒸发，成功地建立了适合苹果等果树离体材料的常温缓慢生长法保存技术。 应用该技术，苹果离体茎段在常温下至少可以连续保存1a以上，最长的可以保存 25个月：梨和石榴离体茎段可以连续保存7个月以上。 5以多个具有代表性的基因型为材料，确立了苹果和梨常低温保存中适宜的外 植体类型和通用培养基。完善了苹果和梨离体茎段的常低温保存技术，使得苹果和 梨离体茎段在3±0．5C条件下，保存28个月和24个月后，仍保持近100％存活率。 进一步完善了苹果茎段的超低温保存技术，确立了甘油和ABA在预处理中的重要作 苹果等果树种质资源的离体保存研究 用。 6研究了外植体类型和培养基中的氮素水平对梨茎段离体开花的影响，结果表 明，果苔副梢比一次新梢更容易成花：降低培养基中的氮素水平，提高碳氮比可以 提高成花率。在1／3MS—N的继代培养基中，果苔副梢的成花率达到50％，而对照新 梢仅为15％。 7在梨离体枝条常低温保存后恢复生长时发现，保存在较高碳氮比培养基上的 枝条发生了成花现象。其中保存在1／2MS大量元素+_1009／L蔗糖培养基上的枝条， 成花率达到80％。梨离体枝条高频率成花体系的建立为研究影响花芽分化的因素， 尤其是花器官发育的分子生物学奠定了良好的技术平台。 8对来自苹果叶片再生的单胚系的遗传变异进行了研究。倍性分析仪的分析结 果表明，供试的104个单胚系均未发生倍性的变化，与供体材料一样均为二倍体。 但不同的单胚系之间AFLP指纹存在差异，位点变异率为0．099％；在不同的单胚系 之间存在相同的变异位点，说明存在突变热点。 9对经常温缓慢生长法和超低温保存后的富士单胚系的遗传变异进行了研究。 倍性分析仪和AFLP的分析结果表明，经两种保存方法保存后均未发生倍性的变化， 但是AFLP指纹均发生了变化。位点变异率分别为0．190％和O．387％。 10对经超低温保存后的两条变异带进行了回收测序及功能分析，结果表明，A 多个阅读框架，与拟南芥、水稻和玉米基因组的部分序列具有较高的同源性；并且 nexin．1ike 与其同源的拟南芥5号染色体上的碱基序列为